Thuốc thử Barfoed: Thuốc thử này trông giống thuốc thử Benedict
nhưng hơi khác một chút . Dung dịch được chuẩn bị bằng cách hòa tan 70g Đồng acetat monohydrat với 9ml axít acetic băng trong nước sau đó đưa vào bình định mức 1lít rồi thêm nước cho đến vạch định mức, dung dịch có thể sử dụng trong thời hạn một năm.
Khi 1ml dung dịch thuốc thử này được đun nóng với 5 giọt chất mẫu, kết quả dương tính đối với monosacarit là sự hình thành kết tủa đỏ gạch tồn tại trong vòng 5 phút. Còn disacarit nhìn chung không thấy phản ứng xảy ra sau 10 phút đun nóng với thuốc thử. Kết tủa sẽ không đóng váng như khi thử với thuốc thử Benedict.
Thuốc thử Benedict: Chúng tôi thường dùng thuốc thử bán trên thị trường vì nó có tính ổn
định cao hơn dung dịch pha chế trong phòng thí nghiệm. Hiện nay ở Việt Nam chưa thấy xuất hiện thuốc thử này, thường nếu muốn mua bạn phải nhập khẩu. Dung dịch pha chế trong phòng thí nghiệm được phân ra hai loại, một là dung dịch thô dùng cho phân tích định tính, hai là dùng cho phân tích định lượng:
• Với dung dịch thô tiến hành như sau: trước hết hòa tan 100g Na2CO3 và 173g Natri Citrat dihydrat trong 850ml nước, khuấy đều và cho từ từ dung dịch của 17.3 g Đồng sulfat trong 100ml nước. Sau đó thêm hỗn hợp vào bình định mức 1lít và thêm nước đến vạch chỉ định, thuốc thử có thể sử dụng lâu dài.
• Trong 600ml nước nóng hòa tan các chất sau: - 200g Natri citrat (C6H5Na3O7)
- 75g Natri cabonat - 125g Kali thiocynat
Trong 100ml nước hòa tan - 18g CuSO4.5H2O
Khi các dung dịch đã nguội trộn chúng với nhau và khuấy đều sau đó thêm 5ml dung dịch Kali
Ferocyanit rồi thêm nước vào cho đủ 1lít.
Khi 1ml dung dịch thuốc thử được đun nóng với 5 giọt chất mẫu trong một cốc nước, dấu hiệu tích cực khi kiểm tra sự có mặt của đường khử là hình thành kết tủa trong 5 phút. Khoảng biến màu từ xanh lá cho đến vàng rồi chuyển qua màu cam sau đó là màu đỏ gạch tùy thuộc vào hàm lượng đường khử có trong chất mẫu; với một mẫu chứa 1% glucose thì màu của kết tủa thường là đỏ gạch.
Thuốc thử Bial: Hòa tan 3 g orcinol (C7H8O2) trong 500 mL axít HCl đậm đặc, thêm 2,5 ml dung dịch feric clorua hexahydrat 10% và hòa tan hỗn hợp thành 1lít với nước và lúc này HCl xấp xỉ 6M. Thuốc thử chỉ bền trong vòng vài tuần, nhưng tôi chưa thử để lâu hơn, bạn hãy thử xem sao. Thuốc thử Bial được pha chế theo cách cổ điển được chuẩn bị trong 1lít HCl đậm đặc không pha loãng với nước. Dung dịch này phản ứng nhanh hơn (30-60 giây) nhưng kém bền so với thuốc thử pha chế bằng phương pháp nêu trên và hơi của HCl đậm đặc là cả một vấn đề nan giải. Và bạn cũng có thể dùng HCl 4M vẫn phản ứng tốt nhưng chậm và cho màu yếu hơn.
• Khi 1ml dd thuôc thử được đun nóng với 5 giọt chất mẫu trong một cốc nước thì dấu hiệu tích cực với pentose(phân tử đường chứa 5 cacbon) là sử đổi màu dung dịch từ xanh lá sang xanh da trời trong chốc lát.
Thuốc thử Biuret: Thêm 300ml dung dịch NaOH 10% về thể tích vào 500ml dung dịch
chứa 0.3% đồng sulfat pentahydrat và 1.2% Kali Tartrat (C4H4K2O6) khuấy đều rồi pha loãng thành 1lít dung dịch. Sau đó để dung dịch ở chỗ tối ngay để tránh thuốc thử bị biến tính. · Thuốc thử có thể dùng trong phân tích định tính và định lượng. Trong một phản ứng tiêu biểu một phần thể tích của mẫu được trộn với 2 phần thể tích của thuốc thử; tỉ số tối giản phụ thuộc vào nồng độ tối đa của protein mà bạn muốn phát hiện. Sự xuất hiện của protein sẽ cho ra màu tìm với bước sóng hấp thụ khoảng 550-555nm, chúng tôi thường đọc được ở 540nm.
Thuốc thử Bradford: Hòa tan 100mg Coomassie Blue G-250 (C41H44N3NaO6S2) trong 50 mL etanol 95%, Thêm 100ml dung dịch axít photphoric 85%, và pha loãng đến 1lít. Thuốc thử cần được lọc ít nhất một lần, nếu thấy chưa hài lòng bạn có thể lọc 2 đến 3 lần khi thấy kết tủa xuất hiện trong duc dịch. Thuốc thử Bradford có bán trên thị trường với cấu trúc tương đối bền. Tôi nghe một số người nói rằng công thức của Sigma dùng 40ml metanol 4% và 120ml photphoric axít 10%. Tôi đã thử nhưng không thấy gì tốt hơn phương pháp cổ điển
cả. Người ta nói dung dịch này kém bền nhưng tôi đã dùng cả năm nay không thấy vấn đề gì.
· Để định lượng protein hãy trộn 0.25ml mẫu với 2.5 ml thuốc thử Bradford. Sau 5 phút đo phổ hấp thụ ở 595nm. Một điểm bất lợi của thuốc thử này là nó cho ra một khoảng trắng dài làm ảnh hưởng đến kết quả đọc phổ bởi vì một số thuốc thử dính chặt với cuvét. Một điểm bất lợi khác nữa là thuốc thử này rất nhạy với dung dịch tẩy rửa nếu như dụng cụ thủy tinh không được rửa lại sạch thì có nghĩa là bạn đang nghiên cứu về khả năng hòa tan của màng protien trong chất tẩy rửa.
Thuốc thử DNSA: Thuốc thử này dùng để phát hiện nhóm khử cuối mạch của hydrocarbon
và tôi thấy nó rất hữu dụng trong nhiều thí nghiệm. Thành phần của nó là 1% của 3,5- dinitrosalicylic Axít (DNSA), 30% Natri Kali Tartrat và 0.4M NaOH. Thuốc thử này rất bền và sau vài năm cất trữ có một vài vẫn đen xuất hiện trong dung dịch, mặc dù cũ nhưng vẫn sử dụng tốt.
• Trong một phản ứng tiêu biểu, cùng một thể tích của mẫu và thuốc thử được đun nóng trong cốc nước sôi khoảng 10 phút. Sau đó để nguội và đó pha loãng với 10 phần thể tích nước đo phổ hấp thụ thu được bước sóng 540nm. Tôi thường dùng khoảng 0.4 ml mẫu và DNSA và sau khi đun nóng hòa tan với 4ml nước, thu được một hỗn hợp vừa đủ để chạy phổ hấp thụ. Khi không có nhóm khử nào xuất hiện thì màu thu được là màu vàng và khoảng hấp thụ từ 0.03-0.05, dấu hiệu tích cực là màu đỏ tạo thành với khoảng hấp thụ trên 1.0.
Thuôc thử Lowry:
· Thuốc thử 1: trộn lẫn một phần thể tích thuốc thử B (0.5% đồng sulfat pentahydrat, 1% Kali tartrat) với 50 phần thể tích của thuốc thử A (2% Natri carbonat, 0.4% NaOH). Cả hai thuốc thử A và B bền trong một thời gian tương đối dài nhưng tôi thấy thuốc thử B xuất hiện kết tủa có nghĩa là nó nhắc tôi cho thêm một ít NaOH.
· Thuốc thử 2: Hòa tan thuốc thử Folin-Ciocalteu phenol thương mại với một lượng nước bằng về thể tích , thuốc thử sẽ bền trong vài tuần.
Để định lượng protein trộn 0.25ml dung dịch chứa protein với 2.5 ml thuốc thử Lowry. Sau 10 phút thêm 0.25ml thuốc thử Lowry 2 và lắc đều. Sau 30 phút đo phổ hấp thụ ở 750nm.(Nếu bạn dùng Spectronic 20 với một ống photo thông thường thì 750nm là quá dài, nhưng ở 600nm cho kết quả hấp thụ thấp hơn nhưng vẫn còn chấp nhận được.)
Thuôc thử Seliwanoff: Hòa tan 1g resorcinol (C7H8O2) trong 300ml HCl đậm đặc sau đó pha loãng thành 1lít (lúc này HCl xấp xỉ 4M). Thuốc thử này có thể cất được hơn một năm. · Khi 1ml thuốc thử được đun nóng với 5 giọt chất mẫu trong một cốc nước đang sôi, một dấu hiệu tích cực đối với monosacarit có chứa nhóm ceton là sự chuyển màu của dung dịch từ vàng cam sang đỏ trong vòng 5 phút. Trong một số tài liệu khác thì nói rằng màu quả mơ là kết quả âm tính. Màu sắc của thí nghiệm kết quả phụ thuộc vào nồng độ của chất mẫu, và một vài loại đường như glucose thì không biến màu thậm chí sau mười phút trong thuốc thử.
Thái Phú Khánh Hòa(Internet)
hoahocvietnam.com