1. Cỏc thể lạ của vi rỳt :
Thể lạ cũn được gọi là thể ẩn nhập hay tiểu thể bao hàm (inclusion body) hoặc thể X (X-body).
Đõy là một dạng đặc biệt của vi rỳt thường tỡm gặp trong tế bào động vật hoặc thực vật bị vi rỳt ký sinh. Thớ dụ : trong tế bào bẹ lỏ lỳa bị mắc bệnh lựn xoắn lỏ cú cỏc thể lạ nằm ở gần nhõn của tế bào. Thể lạ này cú kớch thước lớn, 1,5x3à, ăn màu acetocarmin, quan sỏt dễ dàng dưới kớnh hiển vi quang học.
Thể lạ cú thể là do nhiều vi rỳt dớnh cụm lại với nhau và được bao bọc bởi một lớp màng. Thể lạ là cấu trỳc đặc biệt đặc trưng cho từng loài vi rỳt. Tựy loài thể lạ cú hỡnh dạng khỏc nhau và bắt màu khóc nhau đối với cỏc loại thuốc nhuộm.
Đặc tớnh này giỳp chỳng ta chẩn đoỏn một số bệnh trờn động vật và thực vật một cỏch khỏ chớnh xỏc. Nếu phỏt hiện thấy trong tế bào cú thể lạ thỡ chắc chắn rằng tế bào đú đó bị vi rỳt xõm nhiễm. Tuy nhiờn khụng thể kết luận ngược lại vỡ nhiều loài vi rỳt khụng tạo ra thể lạ.
Thể lạ cú thể hỡnh thành trong tế bào chất hoặc trong nhõn, hoặc cú khi cả hai nơi, tựy theo loài vi rỳt. (Hỡnh 7-7)
Hỡnh 7-7: Thể lạ do TMV kết tinh trong lụng tơ ở lỏ cõy thuốc lỏ mắc bệnh đốm. Bờn phải: (C) tinh thể lục giỏc trong suốt; (N) nhõn tế bào thuốc lỏ.
2. Khả năng kết thành tinh thể của vi rỳt :
Cỏc vi sinh vật khỏc như nấm, tảo, vi khuẩn, ... cú cấu tạo tế bào, khụng cú khả năng húa thành tinh thể được. Ngược lại trong một số điều kiện, Vi rỳt lại chuyển biến thành tinh thể.
Vi rỳt gõy bệnh khảm thuốc lỏ cú thể húa tinh thể trong điều kiện thiờn nhiờn. Nếu chỳng ta quan sỏt lụng tơ của lỏ cõy thuốc mắc bệnh khảm sẽ nhỡn thấy cỏc tinh thể của TMV cú hỡnh khối lục giỏc, cú thể quan sỏt được dưới kớnh hiển vi quang học. (Hỡnh 7-7)
Năm 1935, lần đầu tiờn Stenli (V.M Stanley) đó tỏch được tinh thể của TMV bằng phương phỏp xử lý đặc biệt. Tinh thể này cú khả năng gõy bệnh đốm khi đem chỳng tiờm chủng vào cõy thuốc lỏ khỏe.
Quỏ trỡnh tinh thể húa vi rỳt phụ thuộc vào điều kiện mụi trường và tớnh chất lý húa của Vi rỳt. Một số vi rỳt cú thể bị kết tinh khi xử lý bằng muối amonium sunfat. Ngày nay người ta cũn cú thể làm cho vi rỳt bại liệt thành tinh thể khi tạo điểm đẳng điện trong ống nghiệm.
3. Một số đặc tớnh húa học của vi rỳt : a/ Acid nuclờic cựa vi rỳt:
Tựy theo loài, acid nuclờic của vi rỳt cú thể là DNA hoặc RNA. Tất cả vi rỳt thực vật đều chỉ chứa RNA. Đại đa số phage chỉ chứa DNA, trừ một vài loài phage cú kớch thước nhỏ bộ chứa RNA. Vi rỳt gõy bệnh cho người và động vật thỡ hoặc chứa DNA hoặc chứa RNA.
Điểm đặc biệt cần lưu ý là vi rỳt chỉ chứa 1 trong 2 loại acid nuclờic này mà thụi. Cũn vi khuẩn và cỏc vi sinh vật khỏc thỡ vừa chứa DNA vừa chứa cả RNA.
Acid nuclờic của vi rỳt là yếu tố chớnh gõy độc (gõy bệnh) cho ký chủ. Điều này được chứng minh sau khi Frenken và Conrat (Fraenkel and Konrat, 1955) đó tỏch được vỏ và acid nuclờic của vi rỳt TMV. Khi tiờm acid nuclờic của TMV vào cõy thuốc khỏe, làm cõy thuốc mắc bệnh.
Vỏ bọc (capxit) cú tỏc dụng che chở cho acid nuclờic bờn trong khi capxit cũn nguyờn vẹn thỡ acid nuclờic khụng bị cỏc men đờzụxy ribụnuclờic hoặc ribụnuclờic phỏ hủy.
b/ Lắp rỏp nhõn tạo vi rỳt:
Năm 1955 Frenken và Conrat đó làm thớ nghiệm tỏch vi rỳt TMV ra làm 2 phần riờng lẻ : prụtờin và acid nuclờic.
Hai ụng thực hiện bằng cỏch thẩm tớch dung dịch vi rỳt TMV trong dung dịch đệm (buffer) glixin, pH = 10,5 trong 48 - 72 giờ. Sau đú thờm đến 1% dung dịch natridodexyl sunfat (detergent) vào dung dịch vi rỳt. Sau đú điều chỉnh pH đến 8,5 và giữ ở 4oC trong 16 - 20 giờ. Cho thờm muối amonium sunfat để kết tủa prụtờin. Quay ly tõm để tỏch prụtờin ra. Acid nuclờic tan trong dung dịch, khi làm lạnh sẽ lắng xuống.
Sau đú hai ụng lại lắp rỏp lại vi rỳt TMV từ hai thành phần đó tỏch ra được ở trờn. Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch acid nuclờic 1o/oo điều chỉnh pH = 6,0 giữ ở 3oC trong vũng 24 giờ thỡ prụtờin cú thể kết hợp với acid nuclờic để tạo thành hạt vi rỳt TMV hoàn toàn.
Như vậy, từ những thành phần riờng lẻ khụng cú hoạt tớnh, người ta cú thể tạo thành một thể sống, dự đú chỉ là thể sống đơn giản nhất.
Điều đỏng chỳ ý là khi acid nuclờic khụng được vỏ prụtờin che chở thỡ giảm khả năng gõy bệnh cho cõy thuốc lỏ rất nhiều, chỉ cũn khả năng gõy bệnh 5% mà thụi. Tuy nhiờn khi lắp rỏp lại với vỏ prụtờin thỡ khả năng này tăng lờn, đạt đến 80%. c/ Hoạt tớnh men của vi rỳt :
Phần lớn vi rỳt khụng cú hệ thống men riờng biệt. Tuy nhiờn phỏt hiện sau này ở một số vi rỳt vẫn cú men đặc biệt. Thớ dụ như vi rỳt cỳm, tiết ra men neuramidaz để phỏ hủy cỏc thụ thể của hồng cầu trong quỏ trỡnh ký sinh gõy bệnh cho người. Vi rỳt gõy bệnh bạch hầu ở gia cầm cú men ađờnụzintriphotphataz. Cỏc phage T2 và T4 cú tiết ra men lizụzim ở đầu cỏc sợi lụng đuụi làm tan màng tế bào vi khuẩn Escherichia coli. Ngoài ra trong giai đoạn co đuụi để tiờm DNA vào tế bào vi khuẩn, phage này cũn tiết ra men ađờnụzintriphụtphataz.
4. Ảnh hưởng của cỏc yếu tố vật lý và húa học đối với vi rỳt :
a/ Húa chất: Cú nhiều loại húa chất, với nồng độ thớch nghi, cú khả năng làm cho vi rỳt mất hoạt tớnh (mất tớnh hoạt động). Thớ dụ như cỏc muối kim loại nặng, cỏc chất kim loại mạnh, cỏc chất tẩy (detergent) ... Trong đú chất lyzol ở nồng độ 3 - 5% cú khả năng làm cho vi rỳt mất hoạt tớnh trong vũng 5 phỳt. Chất này được dựng làm chất sỏt trựng trong khi nghiờn cứu về cỏc Vi rỳt gõy bệnh cho người và sỳc vật.
Khi xử lý vi rỳt với húa chất, vi rỳt cú thể cú hiện tượng bất hoạt thuận nghịch như khi xử lý TMV với formol. Vi rỳt bị bất hoạt, nhưng nếu thẩm tớch để tỏch formol ra khỏi Vi rỳt thỡ vi rỳt hoạt động trở lại. Hoặc nếu xử lý vi rỳt với men tripxin (men phõn hủy prụtờin), vi rỳt bị bất hoạt, vỡ tripxin kết hợp với vi rỳt thành một phức hợp bất hoạt. Khi đun núng lờn để phỏ hủy tripxin, hoặc là dựng nước để pha loóng phức hợp này ra, thỡ hoạt tớnh của vi rỳt lại được phục hồi.
b/ pH của mụi trường cú ảnh hưởng đến hoạt tớnh của vi rỳt. Ở pH = 10, vỏ capxit sẽ bị giải thể, acid nuclờic khụng được bảo vệ nữa và vi rỳt trở nờn bất hoạt (ở một vài loài vi rỳt, capxit cú thể bị giải thể ở pH = 8). Tựy từng loài, vi rỳt cú sức chịu đựng khỏc nhau đối với pH của mụi trường (Bảng 7-2)
Bảng 7-2 : Phạm vi pH của mụi trường của cỏc loài vi rỳt chịu đựng được
LOAèI VI RÚT PHẠM VI pH CHỊU ĐỰNG ĐƯỢC - Đốm - Cỳm - Quai bị - Đậu mựa - Bại liệt - ArboVi rỳt 2,8 - 8,0 6,5 - 9,0 6,5 - 8,5 5,0 - 9,5 1,6 - 10,0 7,5 - 9,5
c/ Nhiệt độ cũng cú ảnh hưởng đến hoạt tớnh của vi rỳt. Tớnh chịu nhiệt của vi rỳt thay đổi tựy loài. Phần lớn vi rỳt bất hoạt ở nhiệt độ 55 - 60oC trong vũng 5 - 30 phỳt. Tuy nhiờn cú những vi rỳt chịu đựng được nhiệt độ cao hơn, như vi rỳt viờm gan cú thể chịu đựng nhiệt độ 80oC trong 30 phỳt. Cỏc phage của vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. oryzae (gõy bệnh chỏy bỡa lỏ lỳa) tại ĐBSCL bị bất hoạt bởi cỏc nhiệt độ sau :
Phage P1 bị bất hoạt ở 60oC trong vũng 10 phỳt. Phage P7 bị bất hoạt ở 70oC trong vũng 10 phỳt. Phage P10 bị bất hoạt ở 85oC trong vũng 10 phỳt.
Ở nhiệt độ 60oC, P10 chỉ mất hoạt tớnh hoàn toàn sau 80 phỳt.
Phần lớn vi rỳt đều thớch nhiệt độ thấp, do đú, khi nghiờn cứu vi rỳt, thường tiến hành trong phũng lạnh cú nhiệt độ cố định 4oC.
Vi rỳt hoàn toàn đảm bảo được hoạt tớnh ở nhiệt độ -75oC. Do đú phương phỏp bảo quản Vi rỳt tốt nhất là phương phỏp đụng khụ (liophilisation), hay phương phỏp làm lạnh đột ngột đến -70oC rồi tồn trữ ở tủ lạnh -20oC. Cỏc phương phỏp này cú thể giữ vi rỳt trong nhiều năm mà vẫn giữ được hoạt tớnh.
Để thanh trựng dụng cụ nghiờn cứu vi rỳt chỳng ta cú thể thanh trựng với hơi nước sụi (100oC) trong 1 giờ.
d/ Tia tử ngoại : (tia cực tớm) cú khả năng làm bất hoạt tất cả vi rỳt. Bước súng 260nm cú tỏc dụng làm bất hoạt cỏc acid nuclờic nhanh chúng. Nếu bước súng ngắn hơn 260nm thỡ prụtờin bị phỏ hủy rất mạnh.
Vi rỳt đó bị chiếu xạ với tia tử ngoại thỡ khụng cũn khả năng gõy bệnh cho ký chủ, nhưng vẫn giữ được đặc tớnh khỏng nguyờn của nú (cú nghĩa là dự bị bất hoạt, nhưng vẫn cú khả năng kớch thớch cơ thể động vật tiết ra khỏng thể, xem thờm ở chương 9).
Đối với một số loài vi rỳt, khi vi rỳt nằm trong tế bào ký chủ, nếu bị chiếu tia tử ngoại thỡ bị bất hoạt, nhưng sau đú nếu được chiếu tia sỏng thường vi rỳt cú thể hoạt động trở lại. Hiện tượng này gọi là phản ứng quang tỏi hoạt (photoreactivation) và khụng xảy ra khi vi rỳt nằm bờn ngoài tế bào ký chủ.
e/ Âm thanh cú tầng số cao hay siờu õm, cú khả năng phỏ hủy vi rỳt khi để trong dung dịch cú khụng khớ hũa tan. Cỏc vi rỳt lớn sẽ bị vỡ ra từng mảnh. Cỏc tớnh chất khỏng nguyờn vẫn giữ nguyờn vẹn. Vai trũ của vi rỳt bị vỡ ra này cú thay đổi trong phản ứng với khỏng huyết thanh.
V. NUễI CẤY VI RÚT :
Vi rỳt là một vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, do đú đặc tớnh chung của cỏc loài vi rỳt là khụng thể phỏt triển trờn mụi trường dinh dưỡng nhõn tạo. Muốn nuụi cấy vi rỳt, chỳng ta phải nuụi chỳng trong tổ chức tế bào ký chủ cũn sống. Tựy theo loại vi rỳt chỳng ta cú thể cú những cỏch nuụi cấy chỳng khỏc nhau.
1. Nuụi cấy vi rỳt gõy bệnh cho người và động vật:
Tựy loài vi rỳt chỳng ta cú thể nuụi cấy chỳng trờn cỏc động vật cảm thụ (chuột, thỏ, bũ, ...) hoặc trong phụi gà đang phỏt triển (trong trứng gà lộn) hoặc nuụi cấy trờn cỏc tế bào đó được nuụi ra bằng phương phỏp nuụi cấy mụ.
a/ Nuụi cấy vi rỳt trờn động vật cảm thụ đó được ỏp dụng với Pasteur mặc dự lỳc ấy ụng chưa nhỡn thấy vi rỳt. Pasteur đó nuụi vi rỳt gõy bệnh chú dại vào nóo thỏ.
Ngày nay tựy từng loại vi rỳt mà người ta chọn cỏc động vật thớch hợp để nuụi cấy vi rỳt ấy. Thớ dụ như với vi rỳt viờm nóo cần nuụi cấy trờn chuột bạch, vi rỳt toi gà được nuụi cấy trờn phụi của trứng gà, vi rỳt bệnh tả heo cần nuụi trờn heo, ... người ta cú thể nuụi vi rỳt trờn bọ, thỏ, khỉ, bồ cõu, bũ, dờ, ...
Tựy theo tớnh chất gõy bệnh của vi rỳt và tựy mục đớch của cụng việc mà người ta lựa chọn đường tiờm vào cỏc cơ quan của con vật cho thớch hợp, như nhỏ vi rỳt cỳm vào lỗ mũi con vật khi tiờm chủng hoặc cũng cú thể tiờm vi rỳt vào khớ quản. Đối với cỏc vi rỳt khỏc người ta cú thể tiờm dưới da, trong da, tiờm vào bắp thịt, vào phỳc mạc, tiờm tĩnh mạch, tiờm vào dõy thần kinh ngoại vi ...
b/ Nuụi cấy vi rỳt trờn phụi gà đang phỏt triển là phương phỏp được sử dụng rộng rói vỡ đa số vi rỳt cú thể phỏt triển trờn phụi gà và vỡ phương phỏp này đơn giản và rẻ tiền. Phương phỏp này thường dựng để nuụi nhõn mật số Vi rỳt lờn, sau đú trớch lấy vi rỳt dựng để nghiờn cứu hoặc dựng làm khỏng nguyờn trong sản xuất vaccin. Người ta soi lỗ ở vỏ trứng hoặc cắt lấy một mảng vỏ trứng, sau đú dựng ống tiờm và kim để tiờm vi rỳt vào tỳi niệu hoặc màng niệu, hoặc lũng đỏ hoặc vào nóo của phụi gà, ... Sau khi trỏm lỗ đó soi lại với parafin vụ trựng, người ta đem ủ ở 37oC trong vũng 3 - 4 ngày. Sau cựng người ta mổ trứng để lấy tổ chức cú Vi rỳt nghiền nỏt và trớch lấy vi rỳt.
c/ Nuụi cấy vi rỳt trờn tổ chức tế bào do cấy mụ là một thành tựu lớn trong ngành vi rỳt học. Nguyờn tắc của phương phỏp này là lấy một nhúm tế bào của người, hoặc động vật thớch hợp, cỏc tế bào sẽ sống và đang phõn cắt. Nếu cứ sau một thời gian lại rửa và thờm dung dịch dinh dưỡng mới thỡ cỏc tế bào sẽ phõn cắt khụng ngừng và người ta dựng cỏc tế bào đú để nuụi cấy vi rỳt.
Phương phỏp này được ứng dụng rất rộng rói để phõn lập, định loài và chuẩn độ vi rỳt. Ngoài ra cũn được dựng rất cú hiệu quả để nghiờn cứu cỏc phản ứng huyết thanh và dựng làm mụi trường chế vaccin.
2. Nuụi cấy vi rỳt gõy bệnh cho thực vật :
Để nuụi cấy vi rỳt gõy bệnh cho thực vật người ta dựng loài cõy cảm thụ (với vi rỳt cần nuụi) được trồng riờng trong nhà kớnh. Thường chọn cõy ngắn ngày để nuụi cấy vi rỳt. Cỏc cõy được trồng theo nhiều đợt để cấy truyền vi rỳt từ cõy ở đợt trước sang cho cõy trồng ở đợt sau.
Cú nhiều cỏch tiờm chủng vi rỳt vào cõy. Tiờm chủng bằng phương phỏp cơ học như tiờm chủng vi rỳt TMV vào cõy thuốc lỏ khỏe mạnh. Trong trường hợp này, người ta lấy lỏ thuốc bị bệnh (cú triệu chứng bệnh điển hỡnh) đem nghiền nhuyển, hũa với dung dịch đệm (buffer) thớch nghi và đem lượt bỏ xỏc. Nước trong lấy được cú vụ số vi rỳt TMV . Ở cõy thuốc lỏ mạnh dựng nuụi cấy, người ta rắc bột than nghiền nhỏ đều lờn cỏc lỏ. Lấy gũn quấn chặt, nhỳng vào dịch chứa vi rỳt và chà xỏc nhẹ lờn lỏ thuốc đó được rắc bột than. Động tỏc này làm cho lụng tơ của lỏ bị góy và cỏc hạt than nhỏ ấn sõu vào biểu bỡ lỏ, tạo vết thương cho sự xõm nhập của vi rỳt TMV.
Cú trường hợp phải tiờm chủng bằng cỏch ghộp mắt hoặc cành bệnh lờn gốc cõy mạnh.
Đối với cỏc vi rỳt chỉ truyền bởi cụn trựng mụi giới, cần sử dụng loại cụn trựng thớch ứng. Cho cụn trựng chớch hỳt cõy bệnh (lấy mầm bệnh), sau đú cho cụn trựng ủ bệnh một thời gian, rồi đem cụn trựng ấy cho chớch hỳt cõy mạnh để truyền bệnh (Thớ dụ trong trường hợp bệnh lựn xoắn lỏ và bệnh vàng lựn trờn lỳa).
Người ta cũng cú thể cấy mụ thực vật trong mụi trường dinh dưỡng và dựng để nuụi cấy vi rỳt.
3. Nuụi cấy thực khuẩn thể (bacteriophage, phage) :
Để nuụi cấy thực khuẩn thể (phage), người ta dựng vi khuẩn cảm thụ với nú. Thớ dụ để nuụi cấy phage P10 chỳng ta phải dựng vi khuẩn Xanthomonas campestris
pv. oryzae chủng Ku 7501. Thụng thường nuụi vi khuẩn trong mụi trường dinh
dưỡng lỏng. Khi mật số vi khuẩn đó lờn cao (1010 - 1011 vk/ml) thỡ ta đổ dịch cú chứa phage vào. Cần lắc hoặc sục khớ để cung cấp ụxy cho vi khuẩn. Sau khi ủ ở 28 - 30oC trong 24 giờ ta cú thể trớch lấy phage. Dựng ly tõm ở 6000 vũng/phỳt trong 20 phỳt để lắng vi khuẩn và mảnh vỡ to của vi khuẩn xuống đỏy ống. Dịch bờn trờn chứa rất nhiều phage, mật số cú thể lờn đến 1012 -1014 phage/ml. Nếu muốn tỏch phage ra khỏi mụi trường lỏng này, cú thể ly tõm cao tốc ở 25.000 vũng/phỳt trong 3 giờ. Phage bị lắng xuống đỏy ống, chắt bỏ nước bờn trờn. Cho dung dịch đệm vào và khuấy mạnh để làm tan phage trong dung dịch đệm. Phage này chưa được tinh khiết vỡ cũn lẫn với cỏc mảnh vỡ nhỏ của tế bào vi khuẩn.