II. SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT
B. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO LƯỜNG SỰ TĂNG TRƯỞN G:
1. Mật số của vi sinh vật :
Là số vi sinh vật ấy trong một đơn vị khụng gian chứa chỳng. Thụng thường ta dựng số vsv/1ml trong trường hợp đếm vi sinh vật trong mụi trường nuụi cấy lỏng, trong nước hoặc trong sữa,... Trong trường hợp vi sinh vật trong đất, chỳng ta thường dựng số vsv/1g đất. Trong trường hợp sợi nấm, cú thể dựng đơn vị là mg/100g dung dịch hoặc dựng tốc độ tăng trương là cm/ngày.
2. Cỏc phương phỏp đếm vi sinh vật:
Cú rất nhiều phương phỏp để đếm vi sinh vật tựy theo mục đớch, phương tiện và loài vi sinh vật. Sau đõy là một vài phương phỏp thụng thường:
a/ Phương phỏp đếm trực tiếp:
- Đếm tế bào sống: Dựng một kớnh đựng vật đặc biệt cú vạch ụ vuụng với diện tớch ụ được biết rừ (hemacytometer). Ta nhỏ lờn khoảng dành để đếm một giọt huyền phự chứa vi sinh vật muốn đếm vào (thớ dụ 1 giọt mỏu). Đậy kớnh đựng vật lại, cú một thể tớch nhất định chứa trong khoảng vuụng để đếm. Chỳng ta dựng kớnh hiển vi để đếm số vi sinh vật chứa trong khoảng vuụng để đếm ấy. Từ đú, suy ra mật số, thường đếm hồng huyết cầu trong mỏu bằng phương phỏp này. Phương phỏp này cho phộp đếm cả vi sinh vật cũn sống lẫn đó chết và chỉ ỏp dụng cho cỏc vi sinh vật khụng cần nhuộm màu (hỡnh 3.3).
Hỡnh 3.3: Sơ đồ một lam đếm hồng cầu (hematocytometer):
(A) nhỡn từ trờn; (B) nhỡn ngang;
(C) phúng to phần vạch chứa huyền phự vi khuẩn.
- Đếm vi sinh vật đó nhuộm (smear count): Nhỏ một thể tớch nhất định của huyền phự muốn đếm lờn một diện tớch nhất định trờn kớnh đựng vật. Định hỡnh và nhuộm màu, thường là với xanh metylen hoặc với loại màu phự hợp với vi sinh vật ấy. Sau đú, đếm số vi sinh vật trờn một đơn vị diện tớch, từ đú suy ra mật số của vi sinh vật ấy.
Phương phỏp này ỏp dụng cho trường hợp phải đếm cỏc vi sinh vật khú quan sỏt phải nhuộm màu. Đếm tổng số vi sinh vật sống và đó chết trong huyền phự.
- Đếm vi sinh vật trờn màng lọc (membrane filter count): Cú thể cho huyền phự chứa vi sinh vật muốn đếm đi qua một phim dinh dưỡng để vi sinh vật mọc thành khuẩn lạc và đếm số khuẩn lạc, suy ra mật số vi sinh vật trong huyền phự . Với cỏch này chỳng ta chỉ đếm được vi sinh vật cũn sống mà thụi.
Chỳng ta cú thể đếm trực tiếp số vi sinh vật trờn màng lọc bằng cỏch nhuộm màu vi sinh vật và làm cho màng lọc trong suốt với immersion oil và đếm số vi sinh vật dưới kớnh hiển vi.
- Phương phỏp pha loóng : Nguyờn tắc của phương phỏp này là pha loóng huyền phự ra nhiều lần. Xong, cho vi sinh vật hiện lờn bằng khuẩn lạc để đếm số vi sinh vật trong huyền phự đó pha loóng, từ đú suy ra mật số của vi sinh vật ấy trong huyền phự gốc.
Kết quả của phương phỏp này cho chỳng ta con số gần đỳng nhất (most probable number) của mật số của huyền phự chứ khụng cú được con số chớnh xỏc .
Phương phỏp này cho phộp đếm vi sinh vật sống, khụng đếm được vi sinh vật đó chết.
Sai số thường rất lớn, do đú phải thực hiện đếm 2 hoặc 3 lần và lấy trị số trung bỡnh, để giảm bớt sai số (hỡnh 3.4).
b/ Phương phỏp đếm giỏn tiếp :
α/ Phương phỏp đo độ đục của huyền phự vi sinh vật (Turbidometric method): Phương phỏp này thường được sử dụng để đếm vi khuẩn và bào tử nấm ở trong một huyền phự .
Nguyờn tắc của phương phỏp này là dựng chựm tia sỏng đơn sắc chiếu xuyờn qua huyền phự chứa vi sinh vật muốn đo, vi sinh vật làm phõn tỏn bớt chựm tia sỏng nhiều hoặc ớt tựy theo mật số của chỳng trong huyền phự. Số tia sỏng cũn lại sau khi xuyờn qua huyền phự sẽ kớch thớch một tế bào quang điện (photoelectric cell). Tựy theo cường độ cũn lại của chựm tia sỏng mà tế bào quang điện nhận được, một cõy kim di động và chỉ số phần trăm tia sỏng bị phõn tỏn trờn bảng chỉ thị (hỡnh 3.5).
Nếu dịch đem đếm khụng chứa vi sinh vật nào cả (thớ dụ như nước cất) thỡ tất cả tia sỏng xuyờn qua và kớch thớch búng đốn quang điện tối đa. Ta điều chỉnh cho kim chỉ thị ở số 100. Đưa huyền phự để đo vào, vỡ cú vi sinh vật trong huyền phự nờn một số tia sỏng bị phõn tỏn đi. Chỉ cũn lại một số ớt xuyờn qua và kớch thớch lờn tế bào quang điện. Kim chỉ thị chỉ số lượng tia sỏng xuyờn qua được. So sỏnh với bảng chuẩn sẽ biết được mật số trong huyền phu. Chỳng ta cú thể ỏp dụng biện phỏp này đối chiếu với phương phỏp đếm trực tiếp để lập một bảng chuẩn cho từng loại vi sinh vật .
Ưu điểm : Là phương phỏp đếm vi sinh vật đơn giản và mau lẹ nhất. Khuyết điểm : - Kết quả là mật số của cả vi sinh vật chết lẫn sống.
- Phải làm cho vi sinh vật phõn phối đều trong huyền phự.
β/ Mỏy đếm điện tử (electronic counter) :
Với mỏy đếm loại này, chỳng ta cú thể đếm được hàng ngàn tế bào vi sinh vật trong vũng vài giõy. Nguyờn tắc là vi sinh vật được đưa qua tia sỏng của “mắt điện tử“ (electronic eye), vi sinh vật cản tia sỏng và ghi dấu hiệu trờn bộ đếm của mỏy .
γ/ Đo trọng lượng khụ của vi sinh vật :
Đõy là phương phỏp đo cỏc vi sinh vật đa bào ( thớ dụ sợi nấm nuụi trong mụi trường dinh dưỡng lỏng và trong trường hợp nầy chỳng ta thường so sỏnh mức độ tăng trưởng hơn là đếm mật số). Thụng thường chỳng ta trớch lấy nấm ấy bằng cỏch ly tõm hoặc lọc, kế đú rửa sạch, sấy khụ và cõn trọng lượng khụ. Sự gia tăng trọng lượng so với lỳc đầu chứng tỏ cú sự tăng trưởng và cho biết tốc độ tăng trưởng của nấm ấy.
Hỡnh 3.4: Sơ đồ mụ tả cỏch đếm vi khuẩn bằng cỏch pha loảng.
Hỡnh 3.5: Nguyờn tắc của phương phỏp đo độ đục của huyền phự vi khuẩn để biết mật số vi khuẩn ấy.
c) Sự tăng trưởng của vi sinh vật :
Trong một mẻ nuụi cấy thớch hợp vi sinh vật thường tăng trưởng theo 4 giai đoạn chớnh (hỡnh 3.6) .
- Giai đoạn chuẩn bị ( latent phase): Trong giai đoạn này, tức là ngay sau khi nuụi cấy, vi sinh vật chưa gia tăng mật số, cú thể đõy là giai đoạn vi sinh vật làm quen với mụi trường nuụi cấy mới và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đo .
- Giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (logarithmic phase, exponential phase): Vi sinh vật sau khi đó am hợp với mụi trường mới và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đú, bắt đầu nhõn mật số lờn với tốc độ rất nhanh theo cấp số nhõn. Trong giai đoạn này mật số tổng cộng và mật số vi sinh vật sống khụng chờnh lệch nhau nhiều vỡ trong giai đoạn này cũn nhiều chất dinh dưỡng cung ứng đủ nhu cầu, nờn số vi sinh vật chết chưa tăng cao.
- Giai đoạn an định (stationary phase): Đõy là giai đoạn mà mật số vi sinh vật khụng tăng thờm mà giữ an định ở một mức. Lỳc này mật số vi sinh vật chết cú tăng nờn mật số tổng cộng đó chờnh lệch so với mật số vi sinh vật sống. Giai đoạn này cú thễ do vi sinh vật thu hỳt và làm cạn dần một vài thành phần dinh dưỡng hoặc là do tỏc động của vài chất đối khỏng do chớnh vi sinh vật ấy tiết ra trong quỏ trỡnh tăng trưởng.
- Giai đoạn chết (death phase): mật số vi sinh vật sống giảm dần trong khi đú mật số vi sinh vật tổng cộng cú hơi tăng nhẹ. Đõy là giai đoạn trựng hợp vào lỳc mà dưỡng chất trong mụi trường bị hao mũn dần hoặc là do sự tớch lũy cỏc chất đối khỏng ngày càng nhiều.
Hỡnh 3.6: Sơ đồ mụ tả sự phỏt triển của vi khuẩn Escherichia coli được nuụi cấy theo phương phỏp nuụi cấy liờn tục: