a/ Phân lồi khoa học
3.4.3Phương pháp định tính Echerichia Coli (E.coli)
3.4.3.1 Ý nghĩa
Đây là phương pháp định tính để kết luận phát hiện hay khơng phát hiện
E.Coli trong một khối lượng hay thể tích mẫu xác định.
Escherichia Coli là chỉ tiêu đánh giá mức độ ơ nhiễm, đặc biêt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm.
3.4.3.2 Nguyên tắc
Cấy mẫu vào mơi trường tăng sinh, kiểm tra trên mơi trường phân lập (EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hố phù hợp (thử nghiệm IMViC).
3.4.3.3 Quy trình phân tích
Chuẩn bị mẫu
Mẫu sau khi lấy được vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ phịng trong thời gian tối đa 1 – 2 giờ.
Tăng sinh
Cấy 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 10ml canh BGBL, ủ ở 440 C trong 24 giờ.
Phân lập
Sau 24 giờ chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (sinh hơi và làm đục mơi trường) cấy chuyển sang mơi trường EMB rồi đem ủ ở 370 C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc E.coli: khuẩn lạc trịn, cĩ màu tím, bờ đều, đường kính 0.5mm, cĩ ánh kim tím. Chọn những khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển qua mơi trường TSA và ủ ở 370 C trong 24 giờ.
Khẳng định
Chọn lấy các khuẩn lạc từ mơi trường TSA cấy chuyển sang các mơi trường thử nghiệm IMViC:
Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy chuyển vi sinh vật từ mơi trường TSA sang canh Trypton ủ ở 370 C trong 24 - 48 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào,
SVTH: Vũ Thị Thắm Trang 40
để yên vài phút và quan sát. Phản ứng dương tính (+) khi xuất hiện vịng đỏ cánh sen trên bề mặt mơi trường, âm tính (-) khi khơng cĩ vịng đỏ xuất hiện.
Thử nghiệm Methyl Red: Nuơi cấy mơi trường MR-VP, ủ ở 37 0 C trong khoảng 2 – 5 ngày . Thêm vài giọt thuốc thử Methyl red ( pha theo tỷ lệ 0.1g trong 300ml cồn và cho nước cất vào để đạt thể tích 500ml). Phản ứng dương tính (+) khi mơi trường chuyển sang màu đỏ, âm tính (-) khi mơi trường khơng đổi màu.
Thử nghiệm Voges – Proskauer: Nuơi cấy mơi trường MR-VP, ủ ở 37 0 C trong khoảng 2 – 5 ngày . Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử α – naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút. Phản ứng dương tính (+) khi xuất hiện màu đỏ trên bề mặt mơi trường, âm tính (+) khi mơi trường khơng đổi màu.
Thử nghiệm Citrate: Nuơi cấy mơi trường thạch nghiêng Simon Citrate agar, ủ ở 37 0 C trong khoảng 24 giờ rồi đọc kết quả. Thử nghiệm dương tính (+) khi mơi trường chuyển sang màu xanh dương, âm tính (-) khi mơi trường khơng đổi màu.
Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm IMViC của E.coli
Stt Thử nghiệm sinh hĩa Kết quả
1 2 3 4 Indol Methyl Red Voges Proskauer Khả năng sử dụng citrate + + - -
SVTH: Vũ Thị Thắm Trang 41