a/ Phân lồi khoa học
3.4.2Phương pháp định lượng Coliform tổng số
Nhĩm Coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Coliforms được xem là nhĩm vi sinh vật chỉ thị: Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm được dùng để chỉ thị sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.
3.4.2.2 Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu nhất định lên mơi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Sau khi ủ ở 370 C 10 C trong 24 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc
coliforms điển hình. Xác định lại bằng phản ứng đặc trưng. Mơi trường chọn lọc
coliforms là mơi trường chứa lactose, đồng thời chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các chất chỉ thị pH như netral red, crystal violet. Trên mơi trường này khuẩn lạc Coliforms cĩ màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc cĩ vùng tủa của muối mật. Khẳng định các dịng khuẩn lạc đặc trưng bằng nuơi cấy trên mơi trường canh chọn lọc như canh BGBL.
Để tránh trường hợp khơng phát hiện được Coliforms do bị tổn thương hay suy yếu do quá trình chế biến, bảo quản hay tiếp xúc với mơi trường chọn lọc làm chúng khơng phát triển thành khuẩn lạc, chúng ta phục hồi khả năng hoạt động của Coliforms bằng một mơi trường chứa nguồn carbon khác như mơi trường TSA.
Số lượng Coliforms được xác định bằng số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, hệ số khẳng định và nồng độ pha lỗng mẫu trước khi mẫu được cấy vào đĩa.
SVTH: Vũ Thị Thắm Trang 36 3.4.2.3 Quy trình phân tích TSA ở 450 C 5 ml Mẫu 1 ml Lắc đều rồi để yên VRB 450C 10 ml
Chờ mơi trường đơng đặc, lật ngược đĩa đem ủ ở 370 C 1 0 C Phục hồi vi sinh vật Chọn lọc coliforms
Hình 3. 4: Phương pháp đổ đĩa định lượng coliforms
Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGB L
Ủ 37oC/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và
sinh hơi
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy)
SVTH: Vũ Thị Thắm Trang 37
Chuẩn bị mẫu
Mẫu sau khi lấy được vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ phịng trong thời gian tối đa 1 – 2 giờ.
Đổ đĩa
Cấy chuyển 1ml mẫu (mẫu khơng pha lỗng) vào đĩa petri vơ trùng, mỗi mẫu cấy 2 đĩa. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml mơi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 450 C. Lắc trịn đĩa petri xuơi và ngược chiều kim đồng hồ 3 - 5 lần để trộn đều mẫu với mơi trường. Để ổn định ở nhiệt độ phịng trong khoảng 1 – 2 giờ nhằm phục hồi các khuẩn lạc bị tổn thương. Đổ thêm 10 – 15 ml mơi trường VRB ở nhiệt độ 450 C lên trên mơi trường TSA.
Nuơi ủ
Chờ cho mơi trường đơng đặc lại, lật ngược đĩa và ủ ở 370C 10 C trong 24 giờ.
Đọc kết quả
Chọn các đĩa cĩ số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc coliforms để tính. Khuẩn lạc
coliforms cĩ màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc cĩ vùng tủa của muối mật.
Khẳng định
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa đã đếm cấy chuyển sang mơi trường canh BGBL và ủ ở 370 C 10 C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính (+) khi vi sinh vật sinh khí trong ống durham và làm đục mơi trường. Tỷ lệ khẳng định là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc đem thử nghiệm.
SVTH: Vũ Thị Thắm Trang 38
Tính kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ khẳng định R, mật độ Coliforms (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
A: Số khuẩn lạc Coliforms trên 1 ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được
n: Số đĩa cĩ số khuẩn lạc được chọn v: Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa f: Độ pha lỗng tương ứng (f = 1)
R: Tỷ lệ xác định
A B
Hình 3. 6: Coliforms trên một số mơi trường
A: Khuẩn lạc Coliforms đặc trưng trên mơi trường VRB B: Coliforms sinh hơi trong mơi trường BGBL
R N
(CFU/ml)
A = ×
SVTH: Vũ Thị Thắm Trang 39