Enzyme thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các tế bào của những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển của lipit từ cơ quan này sang cơ quan khác. Một khía cạnh quan trọng của hệ
enzyme thuỷ phân chất béo là chúng chỉ xúc tác cho các phản ứng lý hoá tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ bề mặt.
Ở những nước công nghiệp phát triển, các chất béo ăn được đã có mặt trong bữa ăn của con người, mà thành phần chủ yếu là triacylglycerols (TAGs) từ 100-150g mỗi ngày, chiếm khoảng 30% năng lượng mà cơ thể đưa vào hàng ngày. Những phân tử TAG không thể tự đi qua màng ruột được. Một chuỗi các phản ứng thuỷ phân và hấp thụ cần xảy ra để giải phóng hoá năng có mặt trong các mạch hydrocacbon của TAG sinh vật có thể sử dụng được.
Enzyme lipase bên trong bộ máy tiêu hóa đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người và những động vật bậc cao.
Các phương pháp dùng để xác định hoạt tính enzyme lipase gồm có phương pháp chuẩn độ, quang phổ, sắc ký, phóng xạ, sức căng bề mặt, đục kế, đo độ dẫn điện, hoá học miễn dịch, hiển vi…
Phản ứng thuỷ phân triacylglycerol được xúc tác bởi enzyme lipase có thể được viết như sau:
TAG = triacylglycerols DAG = diacylglycerols MAG = monoglycerols FFA = free fatty acids.
Một số phương pháp xác định hoạt tính enzyme:
1.5.4.1 Sự biến mất của cơ chất
1. Phương pháp đo độ đục
Trong môi trường rắn :
Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic được dùng làm cơ chất, bản chất là xác định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm. Sự phân giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu trên đĩa thạch.
Hiện tượng quang học này quan sát được khi các acid béo được giải phóng ra hoà tan một phần vào nước. Quá trình sáng màu này là kết quả của sự giảm kích thước của các hạt nhũ bị thuỷ phân có tác dụng làm giảm ánh sáng khuyếch tán.
Kỹ thuật này cũng có thể được áp dụng trong quá trình theo dõi sự thuỷ phân của Tweens do các enzyme lipase khác nhau xúc tác.
Trong môi trường lỏng:
Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ thuật này rất nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ như huyết tương chẳng hạn, thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến quá trình. Vì vậy, enzyme lipase thuần khiết được sử dụng để xây dựng một đường chuẩn.
2. Phương pháp đĩa Wilhelmy:
Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết:
Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc của không khí -nước đã được phát triển rộng và được nhóm nghiên cứu của Fréderic Beisson, Claude Rivìere cũng như nhóm của Brockman sử dụng. Kỹ thuật này về cơ bản gồm một lớp Teflon (lớp chống dính) phủ trên máng, trên đó là một dung dịch. Một bản mỏng Pt nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một electromicrobalance để đo áp suất bề mặt, để xác định sức căng bề mặt.
Phương pháp màng film đơn phân tử thích hợp để nghiên cứu những phản ứng enzyme trên chất béo mà được phân bố tại bề mặt tiếp xúc không khí-nước.
Phương pháp này có độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những phép đo động học đáng tin cậy.
Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất:
Hầu hết những nghiên cứu động học về hoạt động của enzyme thuỷ phân chất béo đã được thực hiện in vitro, dùng những chất béo thuần khiết làm cơ chất. Thực tế, tất cả các mặt phân cách của sinh vật đều là sự pha trộn phức tạp của hỗn hợp gồm lipit và protein. Kỹ thuật đơn lớp lý tưởng thích hợp cho việc nghiên cứu kiểu hoạt động của hệ enzyme thuỷ phân chất béo tại mặt phân cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã được điều chỉnh. Có 2 phương pháp từ hỗn hợp chất béo tạo màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất béo
không tan trong nước vào một dung môi hữu cơ dễ bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của chất tẩy rửa vào trong pha nước, được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan.
Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình Fig 1A.
Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero- order“ để ngăn truyền thông bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng (reaction compartment). Áp suất bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi mà hỗn hợp film được phân bố ở áp suất yêu cầu. Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản Pt tới màng chứa, nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau. Áp suất bề mặt của màng chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển lớp màng chắn di động. Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép những bề mặt tiếp xúc với nhau và enzyme được tiêm vào trong bộ phận phản ứng và kết quả động học được ghi chép như mô tả.
Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp:
Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng giá trị tối ưu xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt. Giá trị chính xác của điểm tối ưu biến đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất được sử dụng. Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này là: Giả thuyết đầu tiên, được đề nghị bởi Hughes và những người làm việc thuộc thế hệ sau ông: Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều hòa mà quá trình phân giải chất béo phụ thuộc.
Sử dụng những enzyme đã được đánh dấu phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động bề mặt của enzyme. Thật vậy, sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỷ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỷ lệ này thường là 1 cm-1, phụ thuộc vào độ sâu của cái máng. Trong khi đó, ở khối lớn tỷ lệ này có thể cao khoảng 10-5 cm-1, phụ thuộc vào lượng lipit sử dụng và trạng thái của sự phân giải lipit. Kết quả là ở trường hợp
của khối lớn sự hấp phụ hầu hết các enzyme xuất hiện tại bề mặt giao tiếp, trong khi ở lớp đơn chỉ có 1 phân tử enzyme trong hàng trăm các enzyme có thể xuất hiện tại bề mặt giao tiếp. Vì ở tình trạng này, một lượng nhỏ không xác định ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ thuỷ phân được hấp phụ trên lớp đơn. Để khắc phục sự giới hạn này thì nhiều phương pháp đã được đề ra để phục hồi và đo lượng enzyme đã được hấp phụ tại bề mặt giao tiếp.
Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman đã chuyển lớp đơn đến 1 mẩu giấy kỵ nước và những enzyme được hấp phụ sau đó được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ. Sau khi so sánh với tốc độ của mẫu trắng và pha mang, số lượng của những enzyme được hấp phụ sẽ được tính toán từ vận tốc của mạng lưới và hoạt động của những enzyme đặc hiệu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong bảng phân tích những enzyme hoạt động phóng xạ, màng film được hút ra bằng cách lồng những đáy của ống mao quản thuỷ tinh cong vào trong chất lỏng và nổi lên trên đỉnh của một phần thành Teflon. Khi những phân tử enzyme được đánh dấu phóng xạ tan trong pha mang sẽ bị hút ra cùng với những thành phần đi kèm với màng film. Kết quả sẽ được kiểm tra dựa trên sự hoạt động phóng xạ trong cùng một thể tích của pha mang được hút ra. Sự khác biệt giữa 2 giá trị thực sự đã phản ánh được hoạt động phóng xạ vượt mức tồn tại ở bề mặt tiếp xúc, được quy cho phân tử enzyme có liên kết với màng film. Bởi vì có thể sử dụng kỹ thuật lớp đơn để đo tốc độ phản ứng được thể hiện bằng đơn vị mol.cm-2.min-1 và sự vượt mức của enzyme ở bề mặt bằng đơn vị mg.cm-2. Ta dễ dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của enzyme thường được đo bằng đơn vị là mol.min-1.mg-1( IU.mg-1).
Bằng cách kết hợp đồng thời 2 kĩ thuật ELISA và kĩ thuật lớp đơn phân tử, ta có thể đo được hoạt tính của enzyme lipase trong đường ruột của người (HGL- Human gastric lipase). Trên lớp màng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol (lớp dicaprin) và cũng có thể xác định được sự vượt mức của enzyme bề mặt tương ứng. Một lượng HGL luân chuyển sẽ gia tăng một cách ổn định với màng bao lipit. Những hoạt tính đặc hiệu được xác định trên lớp dicaprin tại 35mN.m-1 đã được tìm thấy ở cùng một mức độ giá trị khi được đo dưới điều kiện phân tích khối lớn tối ưu, sử dụng cơ chất là chất nhũ hoá tributyrin (liều lượng là 1000IU cho 1mg enzyme). Tại một nồng độ lipase cho trước trong pha mang nước, sự liên kết bề mặt của các HGL với lớp
màng phosphatidylcholine ưa béo của lòng đỏ trứng đã được nhận ra rằng chậm hơn 10 lần so với trường hợp của lớp màng dicaprin.
Tuy nhiên, chúng ta phải lưu ý rằng những phân tử enzyme được liên kết bề mặt không chỉ bao gồm những enzyme đó (là những enzyme liên quan trực tiếp đến sự xúc tác) mà còn một lượng protein không đoán được (được hấp phụ lên lớp đơn). Những enzyme này không liên quan đến sự thuỷ phân enzyme của lớp.
3. Phương pháp hiển vi lực nguyên tử (Atomic force microscopy):
Để theo dõi động học của sự thuỷ phân của màng phospholipids kép bằng phospholipase A2, Nielsen đã làm một thí nghiệm sử dụng phương pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM) trong môi trường chất lỏng. Theo những nghiên cứu này thì sự thuỷ phân enzyme của màng acylglycerols / phospholipids kép bằng enzyme Humicola lanuginosa lipase (HLL) cũng đã được nghiên cứu bằng phương pháp AFM. Màng lipit kép củng cố bởi Mica bị thuỷ phân bởi HLL và vì sản phẩm hoà tan trong dung dịch đệm, các khu vực bị khoét sâu của màng kép sẽ bị phát hiện ra bởi đỉnh AFM. Chúng ta sẽ có được những hình ảnh thời gian thực của sự thuỷ phân xuất hiện ở lớp màng kép và sẽ phân tích chúng bằng phần mềm đã được thiết lập sẵn. Những hình ảnh này sẽ chỉ ra được sự xuất hiện của vết lõm tại bề mặt ở mức xấp xỉ 10-9 một cách gia tăng dần. Thêm vào đó, sự gia tăng diện tích của lỗ hổng ở lớp màng kép lipit mà được ghi nhận như là chức năng thời gian và hoạt tính đặc hiệu của enzyme sẽ được đánh giá với điều kiện một phân tử lipase sẽ hoạt động trong 1 lỗ.
Kết quả được sử dụng để làm mẫu cho động học của phản ứng enzyme tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha béo - nước. Dữ liệu này cung cấp hình ảnh đầu tiên ở tầm Nano của động học quá trình phân giải lipit.
4. Quang phổ học hồng ngoại:
Một phân tích liên tục để đo sự thủy phân của những TAG do lipase xúc tác micell đảo ngược sử dụng Fourier thay đổi quang phổ học hồng ngoại (FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy), được phát triển bởi Walde và Luisi. Sự phân hủy chất béo có thể được theo dõi bằng việc ghi lại phổ FTIR của toàn bộ hỗn hợp phản ứng. Số lượng những ester axit béo và FFAs (mà cực đại đỉnh tương ứng tại 1751cm-1 và tại 1715 cm-1) có thể dựa trên cơ sở của những hệ số tắt và
định luật của Beer. Phương pháp này được ứng dụng để đo sự phân hủy chất béo của những cơ chất khác nhau (như trioctanoyglycerol, các loại dầu thực vật).
1.5.4.2 Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân
1. Sự giải phóng proton như một phép phân tích gián tiếp:
Những chất chỉ thị màu:
Trong môi trường rắn: Khi dung dịch lipase được đặt trên một đĩa agar chứa ester carboxylic như một cơ chất, có thể theo dõi độ pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu của những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân gây ra) mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar. Ở đây tồn tại một mối quan hệ tuyến tính giữa đường kính của đốm (vị trí) khuyếch tán axit béo và logarit của vùng phân bố enzyme. Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh chóng những vi sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar. Tuy nhiên một vài sai sót có thể là kết quả từ quá trình axit hóa của môi trường, vì sự phát sinh của những chất chuyển hóa axit khác với FFAs mà được giải phóng bởi những vi khuẩn lipase.
Trong môi trường chất lỏng: mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này cung cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất ester.
Một phương pháp định tính đơn giản hơn mà dựa vào sự phát hiện những đặc trưng mạnh mẽ về mùi của axit butyric và axit caproic, chúng có mùi của những giọt sữa đã bị thủy phân mà được dùng như một cơ chất lipase.
Phép chuẩn độ:
Phương pháp pH-stat nổi tiếng (Fig 2) nói chung đã được sử dụng như một phép phân tích enzyme lipase khác. Đây là một kỹ thuật tiện lợi để mô tả đặc điểm và sự đặc biệt của lipase cũng như hiện tượng kích hoạt bề mặt tiếp xúc giữa các pha.
Với phương pháp pH-stat, hoạt động của lipase được đo trên một máy khuấy trộn hệ nhũ tương của những TAGs tự nhiên hay chất tổng hợp bằng việc trung hòa FFAs được giải phóng theo thời gian bởi sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì độ pH tại một giá trị điểm cuối không đổi.
Trong trường hợp đặc biệt của lipase/colipase tụy tạng phức tạp, sự phân tích thường chung nhất là được thực hiện trong một máy điều nhiệt (ở 37oC) bình phản ứng hiện chứa đựng 0.5ml tributyrin trong 5ml dung dịch đệm có chứa nước (có pH = 8), trong đó không có mặt của bất kỳ chất hoạt động bề mặt hay hệ nhũ tương nào khác.
Thông thường, tributyrin đơn giản được nhũ tương hóa tại chỗ bởi sự kích thích khuấy trộn cơ học hiệu quả trong bình pH-stat. Hiệu quả của dịch đồng nhất tuần hoàn của dầu oliu được nhũ tương hóa với gum arabic đã được chỉ ra để cải thiện độ nhạy của phép phân tích. Phương pháp pH-stat được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật, có mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với gum arabic như cơ chất. Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính lipase trong huyết thanh, plasma và dịch tá tràng. Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá chính xác (nhạy) trong giới hạn 1mol axit béo được giải phóng trong 1 phút. Khi sử dụng NaOH 0.1 M làm chất chuẩn độ thì phương pháp này không đáng tin cậy trong việc nhận biết được mức độ hoạt động nhỏ hơn 0.1 mol/phút. Ngoài tính nhạy thấp của