Gần đây ứng dụng các phương pháp mới (điện di, sắc ký trao đổi ion, lọc gel…) phối hợp với các biện pháp thường đđược dùng trước đây (biến tính chọn lọc, kết tủa phân đoạn, sắc ký hấp phụ) cho phép thu được phẩm vật của nhiều enzyme với độ thuần khiết cao.
Mặc dù trong việc xây dựng phương pháp mới đã đạt được nhiều kết quả, tuy nhiên vấn đề tách làm thuần khiết enzyme hiện nay vẫn còn là một công tác phức tạp, khó khăn. Nguyên nhân chủ yếu do một mặt enzyme có trong tế bào với lượng rất ít, mặc khác nó luôn có đồng thời với các protein khác cũng có các tính chất lý hoá rất giống nhau, hơn nữa enzyme lại rất không bền, dễ bị mất khả năng xúc tác do tác động của các yếu tố bên ngoài.
Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.
Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.
Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzyme bền nhiệt hoặc bền axit. Dịch enzyme đươc giữ ở 50-70oC hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein (enzyme) ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hoà) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme. Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ. Phương pháp này chỉ dùng với những enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ được chọn dùng. Để giữ cho enzyme khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình phải đươc thực hiện ở nhiệt độ thấp (-5oC).
Phương pháp hấp phụ chọn lọc – hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch enzyme) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzyme. Chất hấp phụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao. Hấp phụ chọn lọc enzyme có thể thực hiện bằng một trong hai cách: chất hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Enzyme sau đó đươc chiết bằng các dung môi thích hợp.
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa tên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein đđược tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc các dẫn xuất ester của xelulloza (cacboxymetylxelluloza, dietylaminoetylxelluloza, trietylaminoetylxelluloza…). Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza
(DEAE-xelluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic. Điều đó cho phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixin sunfat thường được dùng trước đây.
Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của epiclohidrin tạo thành “sàng phân tử”. Số liên kết ngang tạo thành càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp một hỗn hợp gồm nhiều chất trên cột sephadex, các chất phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuyếch tán vào bên trong các sephadex đã đươc ngâm trong dung dịch đệm, còn các phân tử chất có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào các hạt sẽ đươc chiết nhanh khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của các enzyme (12700-1000000) cho phép tách và làm sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp có nhiều triển vọng.
Không có phương pháp tách làm sạch chung cho các enzyme. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzyme nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau.