Xác định bằng phương pháp chuẩn độ, theo phương pháp của Cherry- Crandall. [31, 16, 24]
a. Nguyên tắc:
Hoạt tính enzyme lipase được biểu thị là số µmol axit béo, sinh ra do sự thủy phân chất béo của enzyme lipase có trong 1 ml dịch, trong 1 giờ ở 40oC, pH 8.0, có sử dụng chất nhũ hóa là gum arabic.
b. Hoá chất:
Nhũ tương dầu: cho 100 ml nước cất vào erlen 250ml, bổ sung 7g gum arabic. Hoà trộn cho đến khi tan hoàn toàn. Cho từ từ 100 ml dầu phộng vào, sau đó đem đi đồng hóa cơ học trong 10 phút. Bảo quản trong tủ lạnh, tránh lạnh đông và nơi nhiệt độ cao. Lắc kỹ trước khi sử dụng. Không sử dụng nếu như hệ nhũ tương bị tách pha sau khi lắc.
Chất chỉ thị: hòa tan 1g thylmolphthalein và 0,5 g phenolphthalein trong cồn 95% và định mức lên 100 ml bằng cồn 95%.
Đệm Tris, pH 8.0: trộn 25 ml dung dịch Tris (hydroxymethyl aminomethane) 0,2M (2,43g/100ml) với 25 ml HCl 0,1N. Định mức lên 100 ml bằng nước cất. Kiểm tra lại pH, và điều chỉnh về pH 8,0.
Cồn 95%.
Dung dịch NaOH chuẩn 0,1N.
c. Cách tiến hành: (chuẩn bị 2 mẫu thí nghiệm, 2 mẫu trắng)
Mẫu thí nghiệm Mẫu trắng
Dung dịch đệm pH 8 (ml) 2 2 Nhũ tương dầu (ml) 6 6 Dịch chiết enzyme (ml) 6 6 Cồn 95% (ml) 0 6 Ủ 20 giờ ở 40oC Cồn 95% (ml) 6 0 Nước cất (ml) 20 20 Chất chỉ thị (giọt) 8 8
Lượng NaOH 0,1N chuẩn độ (ml)
Chuẩn độ đến giá trị pH 10,5. (Dung dịch có màu tím)
d. Tính toán kết quả:
Công thức tính hoạt tính lipase (HTL):
V = V2 – V1 là thể tích NaOH 0,1 N dùng điều chỉnh (ml). V1 là thể tích NaOH sử dụng trong bình kiểm chứng (ml). V2 là thể tích NaOH sử dụng trong bình thí nghiệm (ml). N là nồng độ đương lượng của NaOH (N)
Vmẫu là thể tích của dịch chiết enzyme (ml). t là thời gian enzyme xúc tác thủy phân (h).