Xác định bằng phương pháp Anson cải tiến. a. Nguyên tắc:
Hoạt tính enzyme protease được biểu thị là số µg tyrosin, sinh ra do sự thủy phân albumin của enzyme có trong 1 ml dịch, trong 1 phút ở 45oC, pH 7.2.
b. Hóa chất và dịch chiết enzyme: Dung dịch cơ chất protein 2%:
2g albumin + 36 g ure + 8ml dung dịch NaOH 1N + 40ml nước cất, hoà tan.
Bổ sung 10 ml dung dịch đệm photphat pH 7.2; chỉnh về pH 7.2 bằng HCl 2 N. Định mức thành 100ml. Bảo quản trong tủ lạnh.
Dịch enzyme pha loãng: 5 ml mẫu, 2.5 ml dung dịch đệm photphat pH 7.2 sau đó định mức thành 25 ml. (Hệ số pha loãng n = 5).
c. Cách tiến hành:
Lấy 2 ống nghiệm và tiến hành như sau:( Mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần)
Ống mẫu (ml) Ống không (ml) Dung dịch albumin 2% trong
đệm phophat 2 2
Để ở 45oC trong 5 phút
Dung dịch axit tricloacetic 10% 0 4
Dịch enzyme pha loãng 0,4 0
Lắc đều, để ở 45oC trong 10 phút
Dung dịch axit tricloacetic 10% 4 0
Dịch enzyme pha loãng 0 0,4
Lắc đều mỗi ống và để lắng trong khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng, đem lọc. Hút vào các ống nghiệm khác mỗi ống 2 ml dịch lọc, 4 ml dung dịch NaOH 0,5 N và 1 ml thuốc thử Folin pha loãng 6 lần. Lắc kỹ.
Để 15 phút phản ứng. Sau đó đo mật độ quang của dung dịch ớ bước sóng 620 nm.
Xây dựng đường chuẩn tyrosin.
Pha dung dịch tyrosin 100 µg/ml: Lấy 0,1 g tyrosin định mức lên 1000 ml Pha các dung dịch tyrosin chuẩn có nồng độ 0, 5, 10, 15, 20 µg/ml
Dung dịch tyrosin chuẩn (µg/ml) 0 5 10 15 20
Dung dịch tyrosin 100 µg/ml (ml) 0 5 10 15 20
Nước cất (ml) 100 95 90 85 80
d. Tính toán kết quả:
Xác định chênh lệch mật độ quang giữa dung dịch trong ống mẫu và ống không.
Xác định nồng độ tyrosin của ống mẫu từ phương trình đường chuẩn tyrosin. Xác định hoạt tính của enzyme protease.
Công thức tính:
HTP : hoạt tính enzyme protease trong dịch chứa enzyme. C : nồng độ tyrosin của dung dịch trong ống mẫu. Vt : tổng thể tích của dung dịch trong ống mẫu. VE : thể tích của dịch enzyme pha loãng.
t : thời gian phản ứng.(phút) n : hệ số pha loãng.