Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry [5] a. Nguyên tắc:
Hầu hết protein đều chứa tyrosin và tryptophan. Tỷ lệ của những axit amin này trong phân tử tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau thì tỷ lệ các axit amin này trong phân tử của chúng như nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cường độ màu sắc của mẫu thí nghiệm tỷ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng như hàm lượng protein có trong mẫu. Trên nguyên tắc này, ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein tan.
b. Hóa chất:
Dung dịch albumin 0,1%.
Dung dịch A (ddA): 20 g Na2CO3 và 0,5 g Na-K Tartrat trong 1 lít NaOH 0,1N.
Dung dịch B (ddB): 1 g CuSO4 .5H2O trong 1 lít nước.
Dung dịch C (ddC): 45 ml ddA + 5 ml dd B để 24 h trong tủ mát. Thuốc thử Folin.
c. Cách tiến hành:
Dịch enzyme: 5 ml enzyme định mức lên 100 ml bằng nước cất.
Ống M1: 0,2 ml mẫu + 2 ml dd C, để 10 phút rồi thêm 2 ml Folin đã pha loãng 3 lần. Để 30 phút so màu ở 750 nm..
Ống M2 : 0,2 ml nước cất + 2 ml dung dịch C, để 10 phút rồi thêm 0,2 ml Folin đã pha loãng 3 lần. Để 30 phút so màu ở 750 nm.
Xây dựng đường chuẩn Albumin:
Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng đo protein (µg/ml) 0 100 200 300 400 500 Dd Albumin 0,1% (ml) 0 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5 Mật độ quang d. Tính toán kết quả:
Vẽ đồ thị và xác định phương trình đường chuẩn albumin. Xác định mật độ quang của ống mẫu.
Xác định µmol protein tan của ống mẫu từ phương trình đường chuẩn albumin.
Xác định nồng độ protein tan của dịch chứa enzyme.
Nồng độ protein (CP) trong dịch enzyme được tính theo công thức:
Với a : nồng độ protein trong dịch enzyme phân tích (µg/ml). n : hệ số pha loãng.
C : nồng độ protein trong dịch enzyme phân tích (mg/ml).