- Nhiệt sấy khô từ: 4oC đến 27o
b. Phân tích ESI-MS/MS mẫu TTX thô và bột đông khô TTX0,1%
3.1.3.1. Kết quả khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
Tạo file Tune plus tối ưu hóa điều kiện khối phổ cho phân tích TTX.
Gọi phƣơng pháp Tune Plus, chọn chế độ Positive ESI (+ESI), chạy Automatic Tune để tối ƣu hoá điều kiện phân mảnh.
Bƣớc 1: Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm và gọi phƣơng pháp bằng cách: trên cửa sổ Instrument Setup, chọn biểu tƣợng máy khối phổ sẽ xuất hiện hình máy khối phổ.
Bƣớc 2: Nhắp chuột vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ Positive ESI (+ESI).
Bƣớc 3: Bơm dung dịch TTX 10µg/ml vào hệ thống khối phổ với tốc độ dòng 5 l/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion có m/z = 320.
Bƣớc 4: Nhấp vào biểu tƣợng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chế độ Automatic Tune.
Bƣớc 5: Trong ô Mass (m/z), đánh số 320 để Tune cho mảnh 320, và chọn lựa bắn phá mảnh mẹ m/z = 320 thành 4 mảnh con. Máy sẽ tự động điều
38
chỉnh và tối ƣu hoá các thông số sao cho bắt mảnh ion mẹ m/z = 320 cùng với các mảnh con tƣơng ứng tốt và nhạy nhất. Quá trình này mất khoảng 5 phút. Sau khi máy đã tự động điều chỉnh, đƣa ra điều kiện phù hợp để tín hiệu của mảnh ion mẹ m/z 320 tốt hơn và điều kiện để có các mảnh con tối ƣu. Lƣu file Tune lại.
Thiết lập phương pháp LC-MS/MS cho TTX
Mảnh con m/z 162 của TTX đƣợc lựa chọn để định lƣợng TTX. Ở phần Instrument Setup, gọi file Tune đã tạo ở trên. Chọn phân tích khối phổ 2 lần, chế độ SRM, lựa chọn phân mảnh m/z = 320 về mảnh con 162 có tín hiệu tối ƣu: nguồn +ESI, chế độ SRM: m/z 320 -> 162 với mức năng lƣợng CE = 32V, thế ion hóa là 3200V, nhiệt hóa hơi 2000C, nhiệt độ mao quản 3600C.
Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký:
Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký A, B, C, D (bảng 3.2) trên dung dịch chuẩn TTX 10μg/ml thu đƣợc kết quả nhƣ hình 3.18.
Bảng 3.2. Khảo sát một số điều kiện sắc ký
Điều kiện sắc ký A B C D Cột sắc ký Alltech Apollo C8; (5µm; 250 x 4,6mm) Pha động: Đệm acetat – MeOH 20-80 40-60 35 – 65 30 – 70 Tốc độ dòng (µl/phút) 500 400 500 500 Thể tích tiêm (µl) 10 10 10 10
Nguồn ion hoá: +ESI
Khí Sheath Gas (SG) 30 25 25 20
39
Hình 3.18. Sắc ký đồ phân tích TTX theo điều kiện sắc ký A, B, C, D A
B
C
40
Nhận xét: Từ sắc ký đồ thu đƣợc nhận thấy:
Píc trên sắc ký đồ thu đƣợc tƣơng ứng với điều kiện sắc ký A, B, C có thời gian lƣu khoảng 6 – 8 phút, píc doãng, không phù hợp.
Chƣơng trình sắc ký D, píc không bị tù đầu, không bị kéo đuôi, thời gian lƣu 7,1 phút. Do đó, điều kiện sắc ký D phù hợp dùng phân tích TTX.