Chƣơng 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng TTX trong bột đông khô TTX 0,1% bằng sắc ký lỏng khối phổ
a. Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành trên máy LC-MS ba tứ cực nối tiếp Thermo TSQ Quantum Ultra. Khảo sát để tìm điều kiện sắc ký sau:
- Cột sắc ký: Alltech Apollo C8 (250 x 4,6mm; 5µm).
- Pha động: đệm acetat: methanol. Thay đổi tỷ lệ pha động, lựa chọn tỷ lệ phù hợp.
- Tốc độ dòng: điều chỉnh tốc độ dòng để thời gian lƣu phù hợp, đảm bảo mức áp suất qua cột.
- Điều kiện khối phổ cho chƣơng trình sắc ký LC-MS định lƣợng TTX: Lựa chọn tối ƣu hóa cho định lƣợng TTX qua mảnh ion con đặc trƣng: Nguồn
30
ion hóa (+ESI), khí thổi Sheath Gas (SG), khí bổ trợ Auxiliary Gas (AG), nhiệt độ hóa hơi, nhiệt độ mao quản, thế ion hóa) để tín hiệu thu đƣợc tốt, đảm bảo độ nhạy, độ ổn định trong quá trình định lƣợng.
b. Thẩm định lại phương pháp được xây dựng:
- Độ đặc hiệu: Đƣợc tiến hành so sánh tƣơng ứng giữa mẫu chuẩn, mẫu thử bột đông khô và mẫu placebo.
- Độ thích hợp hệ thống: Xác định bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) diện tích pic cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần.
- Độ tuyến tính: Độ tuyến tính biểu thị sự tƣơng quan hồi qui giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích.
Phân tích mẫu, xác định phƣơng trình hồi qui y=ax+b giữa diện tích píc và nồng độ TTX. Xác định hệ số tƣơng quan r.
- Độ lặp lại: Tiến hành định lƣợng 6 lần mẫu thử bột đông khô TTX 0,1%. Xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) hàm lƣợng TTX.
- Độ đúng: Xác định bằng phƣơng pháp thêm chất chuẩn, định lƣợng hàm lƣợng TTX mẫu thêm chuẩn, xác định tỷ lệ thu hồi. Tiến hành xác định ở 3 mức nồng độ trong khoảng 80% -100% - 120%.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
+ Giới hạn phát hiện (LOD): Xác định dựa vào nhiễu đƣờng nền. Việc xác định tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu đƣợc tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng đo đƣợc trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấp đã biết với đáp ứng của mẫu trắng. Từ đó tính đƣợc nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện đƣợc. Tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu (S/N) nằm giữa 3 – 2 thì có thể đƣợc chấp nhận để thiết lập gới hạn phát hiện.
+ Giới hạn định lƣợng (LOQ) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lƣợng đƣợc với tính đúng và tính chính xác chấp nhận đƣợc. LOQ chấp nhận đƣợc nếu đạt các điều kiện: 1) đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng (tỷ lệ nhiễu S/N = 10); 2) píc của chất
31
cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác 20%. Giới hạn định lƣợng (LOQ) có thể đƣợc tính bằng 3 lần giới hạn phát hiện (LOD).
2.3.3. Xác định một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu TTX thô và sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%