2.2.2.1 Trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Thí nghiệm ảnh hƣởng của thuốc đến ong đa phôi bao gồm: ảnh hƣởng trực tiếp của thuốc lên thành trùng ong đa phôi, tác động của thuốc đến khả năng ký sinh của OĐP khi trứng SCLN bị nhiễm thuốc và ảnh hƣởng của thuốc đến tỷ lệ vũ hóa của ong khi SBKS nhiễm thuốc.
a.Tác động của thuốc trừ sâu đến sự sống sót của ong đa phôi
Mục tiêu: Xác định mức độ mẫn cảm của ong đa phôi C. nacoleiae đối với 4 loại thuốc trừ sâu, bao gồm Abatimec 3.6EC, Chess 50WG, Voliam Targo 63SC, Virtako 40WG.
Phƣơng pháp: Dùng 50 µl dung dịch thuốc tráng đều thành trong của ống nghiệm (cao 7,5cm và đƣờng kính 1cm), nƣớc cất đƣợc sử dụng cho nghiệm thức đối chứng. Để ong đa phôi không bị chết do bị dính cánh lên thành ống nghiệm thì để ống nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm 45–60 phút cho đến khi thấy dung dịch thuốc không đọng thành giọt lên thành ống. 5 ong đa phôi đƣợc thả vào một ống nghiệm với một miếng gòn nhỏ tẩm mật ong 10% là thức ăn cho ong. Miệng ống nghiệm đƣợc đậy bằng một mảnh vải thoáng khi nhƣng ong không thể chui ra ngoài. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 5 lần cho từng loại thuốc.
Chỉ tiêu ghi nhận: Tỷ lệ chết của ong đa phôi ở các mốc thời gian nhƣ sau 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 giờ sau khi xử lý thuốc. Từ đó xác định tác động của thuốc đối với OĐP.
b. Ảnh hƣởng của 4 loại thuốc trừ sâu đến khả năng ký sinh của OĐP khi trứng SCLN bị nhiễm thuốc. trứng SCLN bị nhiễm thuốc.
Mục tiêu: Xác định ảnh hƣởng của 4 loại thuốc đến pha trứng của ong đa
phôi C. nacoleiae khi trứng sâu cuốn lá nhỏ bị nhiễm thuốc.
Phƣơng pháp: Thu thành trùng SCLN ở những ruộng không phun thuốc, sau đó cho 50 thành trùng SCLN vào một hộp nhựa, trong đó có cây lúa để bƣớm có nơi chú ẩn. Về phòng thí nghiệm, thả thành trùng SCLN lên cây lúa Jasmine 85 giai đoạn 25–30 ngày để cho bƣớm đẻ trứng, cung cấp thức ăn là mật ong pha loãng 10% cho bƣớm. Hai ngày sau khi thả bƣớm, tiến hành quan sát nếu thấy có trứng sâu trên lúa thì thu lên phòng thí nghiệm, lựa chọn những trứng sắp nở (có hai mắt) để làm thí nghiệm vì giai đoạn này ong ký sinh hiệu quả nhất.
Chọn những lá có từng cụm 5 trứng và cắt hai đầu lá với độ dài đoạn lá khoảng 5cm. Dán hai đầu lá bằng băng keo để tránh lá bị héo và cong lại khi mất nƣớc. Nhúng những đoạn lá có trứng vào thuốc trong 10 giây, sử dụng nƣớc cất ở nghiệm thức đối chứng.
Hình 2.4 Quy trình khảo sát tác động của thuốc đối với khả năng ký sinh của ong C. nacoleiae (A–F)
(A: cho thành trùng SCLN đẻ trứng trên cây lúa, B: Cụm trứng SCLN sắp nở trên đoạn lá lúa đƣợc dán keo hai đầu, C: Đoạn lá lúa có trứng SCLN nhiễm thuốc trong lọ thủy tinh, D: lọ thủy tinh có trứng SCLN nhiễm thuốc và ong đa phôi, E:
ấu trùng SCLN đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm, F: Sâu cuốn lá đƣợc nuôi trong nhà lƣới).
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 5 lần cho mỗi loại thuốc, mỗi lần lặp lại gồm 5 trứng. Sau đó để lá khô tự nhiên rồi cho lá vào lọ thủy tinh (cao 5cm và đƣờng kính 2cm) với mỗi nắp lọ có để bông gòn nhúng mật ong 10%. Chọn những
thành trùng ong đa phôi C. nacoleiae cái khỏe mạnh cho vào mỗi lọ 5 thành
A D F E C B
trùng ong cái. Sau 12 giờ thì lấy trứng ra khỏi lọ thủy tinh và để vào đĩa petri đã có giấy thấm ẩm đã chuẩn bị trƣớc đó. Đến khi trứng nở thì cho lúa non vào để cho sâu ăn, hai ngày thay thức ăn cho sâu một lần trong quá trình làm thí nghiệm hạn chế thấp nhất tổn thƣơng sâu tuổi 1 vì ở tuổi này sâu rất yếu. Khi sâu sang tuổi hai thì thả sâu lên cây lúa 15–20 ngày để sâu hoàn thành vòng đời dƣới điều kiện nhà lƣới. Cách thả sâu xuống cây lúa: thả riêng mỗi nghiệm thức thuốc với mỗi sâu non trên một cây lúa, dùng lồng lƣới đậy chung nhóm những cây lúa cùng nghiệm thức để bảo vệ sâu tránh bị các loài ký sinh hay ăn mồi khác tấn công.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ trứng không nở ở mỗi nghiệm thức và số SBKS đƣợc hình thành.
c.Ảnh hƣởng của 4 loại thuốc đến khả năng vũ hóa của OĐP khi sâu cuốn lá nhỏ nhiễm đa phôi bị nhiễm thuốc. nhỏ nhiễm đa phôi bị nhiễm thuốc.
Mục tiêu: Xác định ảnh hƣởng của 4 loại thuốc Abatimec 3.6EC, Chess 50WG, Voliam Targo 63SC, Virtako 40WG đến khả năng sống sót của ong ký
sinh C. nacoleiae khi SCLN đã bị ký sinh bị nhiễm thuốc.
Phƣơng pháp: Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên những SCLN đã bị OĐP ký sinh. Chọn SBKS tƣơng đối đồng đều về tuổi. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho từng loại thuốc, mỗi lần lặp lại là 3 SCLN đã bị ký sinh. Nhúng SCLN này vào từng loại thuốc khảo sát trong 10 giây, sử dụng nƣớc cất cho nghiệm thức đối chứng. Sau đó quan sát tỷ lệ sống sót và thời gian sống sót của OĐP sau khi vũ hóa.
2.2.2.2 Trong điều kiện nhà lƣới
a. Tính độc của 4 loại thuốc trừ sâu đối với ong đa phôi C. nacoleiae.
Mục tiêu thí nghiệm: Xác định sự mẫn cảm của ong đa phôi C. nacoleiae
đối với 4 loại thuốc (bao gồm Abatimec 3.6EC, Chess 50WG, Voliam Targo 63SC, Virtako 40WG) khi xử lý thuốc trên cây lúa.
Phƣơng pháp: Thuốc ở nồng độ khuyến cáo đƣợc phun đều lên những những chậu lúa Jasmine 85 (15–20) ngày tuổi bằng máy phun thuốc tự động với thời gian 5 giây, sử dụng nƣớc cất cho nghiệm thức đối chứng. Những chậu lúa sau khi phun thuốc đƣợc để khô tự nhiên trong nhà lƣới khoảng 1– 2 giờ, sau đó mỗi chậu lúa đƣợc để vào hộp nhựa (12 x15cm). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho mỗi loại thuốc, mỗi lần lặp lại là 3 chậu lúa (9 chậu lúa cho một nghiệm thức) đã phun thuốc. Thả vào mỗi hộp nhựa có lúa đã đƣợc phun thuốc 40 ong đa phôi khỏe mạnh, sau đó đậy hộp nhựa lại bằng một mảnh vải để ngăn ong thoát
ra ngoài nhƣng thoáng khí, cùng với cục bông gòn có thấm mật ong pha loãng 10% làm thức ăn cho ong đƣợc treo bên trong hộp.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ ong đa phôi chết vào các thời điểm 6, 12 và 24 giờ sau khi thả ong vào. Khi lấy chỉ tiêu chọn ngẫu nhiên ba hộp nhựa trong 9 hộp nhựa của 1 nghiệm thức, sau khi ghi nhận chỉ tiêu thì bỏ lần lặp lại đó.
Hình 2.5 Hộp nhựa (có cây lúa) đƣợc chuẩn bị cho các khảo sát về tác động của thuốc trừ sâu đối với (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ong đa phôi trong điều kiện nhà lƣới.
b. Sự lƣu tồn của 4 loại thuốc trừ sâu và ảnh hƣởng của sự lƣu tồn thuốc đến sự sống sót của ong đa phôi.
Mục tiêu thí nghiệm: Xác định sự lƣu tồn của 4 loại thuốc (bao gồm Abatimec 3.6EC, Chess 50WG, Voliam Targo 63SC, Virtako 40WG) trên cây
lúa và sự ảnh hƣởng của sự lƣu tồn thuốc đến sự sống sót của ong đa phôi C.
nacoleiae trong điều kiện nhà lƣới.
Phƣơng pháp: Thí nghiệm đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ thí nghiệm “tính độc của thuốc đối với ong đa phôi trên cây lúa”. Tuy nhiên khảo sát đƣợc thực hiện ở 3 thời điểm lƣu tồn của thuốc là 5, 10 và 15 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sống sót của thành trùng ong đa phôi C. nacoleiae
ở thời điểm 12 giờ sau khi thả ong lên cây lúa đã đƣợc phun thuốc từ 5 ngày, 10 ngày và 15 ngày trƣớc đó.
Xử lý số liệu:
Số liệu đƣợc xử lý bằng Excel. Phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC. Số liệu (% ) đƣợc đổi sang arcsin trƣớc khi phân tích thống kê.
Tính độc của thuốc đƣợc xác định qua độ hữu hiệu của thuốc. Độ hữu hiệu (%) đƣợc xác định bằng công thức Abbott.
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ONG ĐA PHÔI
COPIDOSOMOPSIS NACOLEIAE
3.1.1 Đặc điểm phát triển và mối liên hệ giữa ký sinh và ký chủ.
Bảng 3.1: Sự liên hệ giữa thời gian phát triển của ong đa phôi C. nacoleiae
(Eady) với ký chủ Cnaphalocrosis medinalis Guenée trên giống lúa Jasmine 85 trong điều kiện nhà lƣới.
(TºC: 23 – 29; RH%: 51 – 85)
Ngày sau khi trứng đƣợc đẻ
Các giai đoạn phát triển của ký sinh (OĐP) và ký chủ (SCLN)
KCBKS KCKBKS Ký sinh (OĐP) 1–3 Trứng Trứng Trứng 4–11 Ấu trùng tuổi 1, 2, 3 Ấu trùng tuổi 1, 2, 3 Trứng phân cắt
Ấu trùng bảo vệ xuất hiện và phát triển 12–18 Ấu trùng tuổi 4, 5 Ấu trùng tuổi 4, 5 Ấu trùng sinh sản nở ra từ trứng Ấu trùng bảo vệ biến mất
19–22 Nhộng Ấu trùng tuổi 5
Ấu trùng sinh sản phát triển và hoàn thành giai đoạn ấu trùng.
23 Nhộng Ấu trùng tuổi 5 Nhộng 24–26 Tiền đẻ trứng Ấu trùng tuổi 5 Nhộng 27–29 Bƣớm Ấu trùng tuổi 5 Nhộng
KCBKS: ký chủ bị ký sinh; KCKBKS: ký chủ không bị ký sinh
Từ kết quả ghi nhận ở Bảng 3.1cho thấy:
Giai đoạn trứng:
Giai đoạn đầu khi OĐP ký sinh lên trứng SCLN thì bên ngoài trứng của ký chủ không có biểu hiện gì (hình 3.1). Ong có thể ký sinh lên tất cả các giai đoạn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
của trứng, nhƣng đặc biệt ở giai đoạn trứng có hai chấm màu đen (điểm mắt đã hình thành trong trứng) thì tỷ lệ ký sinh cao nhất.
Hình 3.1 Ong C. nacoleiae ký sinh lên trứng sâu cuốn lá nhỏ
Giai đoạn ấu trùng:
Ở tuổi 1 đến tuổi 3, khi bị ký sinh ấu trùng sâu cuốn lá nhỏ vẫn phát triển
bình thƣờng. Bƣớc sang tuổi 4 thì trứng ong C. nacoleiae bên trong cơ thể sâu
bắt đầu nở, tuy nhiên vào giai đoạn này khi nhìn bên ngoài cũng rất khó biết đƣợc sâu đã bị ký sinh, tuy nhiên hoạt động của sâu bắt đầu chậm lại và sâu ít ăn. Vào tuổi 5 biểu hiện SCLN bị ký sinh đa biểu hiện rõ, cơ thể sâu chuyển sang
màu hồng hoặc màu vàng, một số trƣờng hợp có thể nhìn thấy ấu trùng ong C.
nacoleiae bên trong cơ thể sâu cuốn lá nhỏ khi quan sát dƣới kính lúp với độ phóng đại khoảng 40 lần (hình 3.2).
Hình 3.3 Ấu trùng sâu cuốn lá nhỏ bị ký sinh
Ấu trùng SCLN bị ký sinh thƣờng kéo tơ hình thành bao nhộng trƣớc các cá thể sâu không bị ký sinh. Trong bao sâu chết dần do bị ấu trùng ong đa phôi ăn hết nội quan, da sâu ốp sát và bao lấy các ấu trùng OĐP bên trong cơ thể sâu, lúc này cơ thể sâu có màu trắng sữa và có thể thấy rõ ràng những ấu trùng ong đa phôi bên trong cơ thể sâu bằng mắt thƣờng.
Cơ thể sâu khô dần cho đến khi chỉ còn một lớp da mỏng bên ngoài bao bọc lấy nhộng ong đa phôi. Khi da của sâu cuốn lá nhỏ khô và căng phồng thì các lỗ thở hai bên bụng cũng rộng hơn tạo điều kiện thuận lợi để sau này ong vũ hóa chui ra khỏi cơ thể sâu. SBKS chuyển từ màu vàng sang màu đen khi OĐP gần vũ hóa (hình 3.3).
Giai đoạn nhộng:
Nhộng của SBKS có triệu chứng rất điển hình nên dễ dàng nhận ra, do sâu chỉ nhả tơ tạo thành bao nhộng chứ không hóa nhộng nên kích thƣớc của bao nhộng SBKS dài hơn so với bao nhộng bình thƣờng. Bên cạnh đó thì sau khi bị ký sinh sâu ít ăn nên sâu thƣờng cắn lá tạo kén trên những lá xanh rất ít bị dấu vết
bị mất diệp lục do sâu gây hại, kén của những sâu cuốn lá nhỏ bị ong C.
nacoleiae ký sinh thƣờng nguyên vẹn không có hiện tƣợng bạc lá.
Có sự liên hệ chặt chẽ về sự phát triển giữa SCLN và OĐP, tuy nhiên thời gian phát triển của ong đa phôi dài hơn sâu cuốn lá nhỏ khoảng 3–5 ngày. Điều
này phù hợp với ghi nhận của Segoli et al. (2009b) trên ong C. koehleri ký sinh
trên ngài hại khoai tây (P. opercullela), khi ong kết thúc giai đoạn ấu trùng sinh
3.1.2 Vòng đời
Bảng 3.2 Thời gian phát triển và vòng đời của ong đa phôi
Copidosomopsis nacoleiae (Eady).
(TºC: 23 – 29; RH%: 51 – 85) Pha phát triển Tổng cá thể SBKS quan sát
Thời gian phát triển của ong đa phôi (ngày) Ngắn nhất Dài nhất Trung bình±SD Trứng 15 10,0 11,0 10,3±0,49 Ấu trùng 15 9,0 11,0 10,7±0,98 Nhộng 15 8,0 8,0 8,0±0,0 Thành trùng 15 1,1 1,7 1,4±0,18 Tiền đẻ trứng 15 2,0–3,0 giờ 0,08 Vòng đời 15 29,0 32,0 30,4±0,95
*SBKS: Sâu cuốn lá nhỏ bị ký sinh
Trứng: Pha trứng của ong C. nacoleiae phát triển bên trong trứng của sâu cuốn lá nhỏ. Ong cái đẻ một trứng hay một vài trứng vào trứng SCLN. Sau một thời gian ngắn thì trứng ong sẽ phân cắt ra thành rất nhiều trứng. Các trứng phát triển trong một ống trứng, ống trứng sau đó dài ra và phân nhiều nhánh.
Hình 3.4 Ống trứng của ong C. nacoleiae
Thời gian từ lúc ong cái đẻ trứng lên trứng sâu cuốn lá cho đến khi trứng phát triển thành ấu trùng trung bình là 10,3±0,49 ngày, khá dài nếu so với loài
(Segoli et al., 2009b). Đặc biệt trong giai đoạn 3–4 ngày đầu, khi phẩu thuật trứng sâu cuốn lá nhỏ ra thì trứng OĐP vẫn chƣa phân cắt. Khi ấu trùng SCLN
tuổi 1 đƣợc 2 ngày tuổi thì trứng ong đa phôi C. nacoleiae bên trong bắt đầu phát
triển và phân cắt, lúc này trứng ong còn rất mỏng manh và chỉ là những đoạn trứng ngắn. Kết quả ghi nhận từ lúc đẻ trứng đến khi trứng bắt đầu phân cắt khoảng 5–6 ngày. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ấu trùng: Khi ấu trùng ong phát triển có thể quan sát thấy chúng trong cơ
thể sâu cuốn lá nhỏ (hình 3.5). Ấu trùng của ong đa phôi C. nacoleiae gồm hai
loại: Ấu trùng bảo vệ (soldier larvae) và ấu trùng sinh sản (reproductive larvae),
chúng bổ sung cho nhau để hoàn thành giai đoạn ấu trùng của ong C. nacoleiae.
Trong đó mỗi loại ấu trùng đảm nhận một vai trò nhất định.
Hình 3.5 Ấu trùng sâu cuốn lá nhỏ bị ký sinh bởi ong C. nacoleiae
Ấu trùng bảo vệ (soldier larvae):
Đây là một dạng ấu trùng khá đặc biệt xuất hiện phổ biến trên ong ký sinh
thuộc họ Encyrtidae (Cruz et al., 1990; Giron et al., 2007; Uka et al., 2013). Đối
với ong C. nacoleiae, kết quả khảo sát ghi nhận ấu trùng bảo vệ xuất hiện ngay
khi ấu trùng sâu cuốn lá nhỏ mới nở (sau khoảng 3–4 ngày từ lúc ong cái đẻ
trứng lên trứng sâu cuốn lá nhỏ). Theo Cruz et al. (1990) ấu trùng bảo vệ có
nhiệm vụ bảo vệ ấu trùng sinh sản, ấu trùng này tấn công các loài khác có trong sâu cuốn lá nhỏ những loài có thể gây hại cho ấu trùng sinh sản và tạo điều kiện
thuận lợi cho ấu trùng của ong C. nacoleiae phát triển thuận lợi nhất sau này.
Theo Cruz (1996) ấu trùng dạng này còn đƣợc gọi là ấu trùng sớm (precocious larvae), chúng tấn công và giết ấu trùng của các loại ký sinh khác trong cùng ký
chủ nhƣ Phanerotoma flavitestacea, Ichneumonids Venturia canescens, Trathala
sp. với tỷ lệ chết lần lƣợt là 74%, 98%, 97% .
Ấu trùng bảo vệ biến mất dần sau khi ấu trùng sinh sản của ong C.
nacoleiae phát triển nghĩa là khoảng từ ngày 11 trở về sau, điều này tƣơng tự với
vệ của OĐP trong khoảng thời gian sau 14 ngày từ khi đẻ trứng. Theo Ode và
Strand (1995) dạng ấu trùng bảo vệ trên ong ký sinh C. floridanum cũng sẽ
không bao giờ phát triển thành thành trùng.
Ấu trùng bảo vệ của ong C. nacoleiae có cơ thể hơi cong, hình giống nhƣ
cánh cung, cơ thể thon với ba phần rõ rệt bao gồm đầu với miệng phát triển, phần thân và đuôi. Khi còn non cơ thể đƣợc bao bọc bởi một lớp da mỏng lúc này thì thân có nhiều ngấn tròn vòng quanh tạo thành các khoang trên cơ thể (hình 3.6). Khi ra khỏi lớp da mỏng thì những khoang này cũng biến mất.
Trong mỗi SBKS xuất hiện nhiều nhất là 6 ấu trùng bảo vệ, điều này hoàn