2.6.1 Ngoài nƣớc
Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng pháp Calcium chloride.
Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp
N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng
OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)
OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl)
Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau:
10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl
Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E. coli khác nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dịch TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày.
2.6.2 Trong nƣớc
Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn
E. coli DH5α” bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập phản ứng nối cho đoạn DNA trên với plasmid, thực hiện phản ứng PCR trên plasmid đã chèn.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp
Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 14 tháng 02 năm 2006 đến ngày 14 tháng 08 năm 2006.
Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α
Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid.
Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15)
hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1.
Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986)
3.2.2 pBluescript II SK(+/-)
pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MCS với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MCS là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự.
pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MCS so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại.
Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) 3.2.3 Đoạn DNA
Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là Đoạn DNA (900bp) của nấm Phytophthora trên cây địa lan Đoạn DNA (223bp) trong vùng Tef của nấm Trichorderma
3.3 Dụng cụ và hóa chất 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri lớn, nhỏ Ống nghiệm lớn, nhỏ Eppendorf: 1.5ml, 200μl Pipet : 0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl
Đầu tip : xanh, vàng, trắng Lọ thủy tinh đƣng hóa chất
Đầu lọc hóa chất : 0.22μm, 0.45μm Bình tam giác : 100ml, 200ml, 500ml Que trang thủy tinh
3.3.2 Các thiết bị máy móc
Tủ cấy vô trùng (micro flow) Bồn ổn nhiệt (water bath) Máy ly tâm (Mikio 22) Tủ định ôn
Máy lắc vi khuẩn Tủ 40C, - 200C, - 800C
Tủ sấy dụng cụ
Thiết bị điện di (Bio - Rad) Máy chụp gel (Bio - Rad) Lò vi sóng (Microway) Nồi hấp (Autoclave - Tomy)
3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )
Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillin)
Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar ) Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillin, X-gal, IPTG)
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm
Hóa chất để chuẩn bị tế bào khả nạp : CaCl2 100mM, glycerol 98%.
Hóa chất biến nạp : Ampicillin 100μg/ml, X-gal 20mg/ml, IPTG 300mg/ml.
Hóa chất ly trích plasmid
Dung dịch I (50mM glucose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA) Dung dịch II (0,2N NaOH, 1% SDS, nƣớc cất)
Dung dịch III (5M Potassium acetate, glacial acetic acid, nƣớc cất) Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1)
Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1)
Isopropanol, Ethanol 70 %, TE 1X (pH = 8)
Hóa chất điện divà nhuộm: Loading dye, TAE 0.5X, Ethdium bromide
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm
Tên enzyme Trình tự nhận
biết Buffer Mã hàng
Nhà sản xuất
BamHI G /GATCC B (10X) Cat. No. 220 612 Roche
EcoRV GAT/ATG B (10X) Cat. No. 667 145 Roche
HindIII A/AGCTT B (10X) Cat. No. 656 313 Roche
DNA T4 ligase NEbuffer 10X Product No. 70005Y usb DNA fragment Klenow T4 reaction buffer Code number M0210S BioLabs
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
Vi khuẩn E. coli sau khi xử lí CaCl2 sẽ làm cho màng tế bào trở nên khả nạp giúp cho DNA xâm nhập tế bào E.coli dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420
C trong 45 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Một trong các tính trạng do các gen này qui định đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt nhữnng tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận DNA plasmid.
Vi khuẩn Ecoli Xử lí CaCl2
Sốc nhiệt ở 420
C trong 45 giây
Cấy lên đĩa
3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra
Sơ đồ 3.3Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra
Vi khuẩn E. coli DH5α + CaCl2 Khả nạp
Plasmid Bluescript II SK (+/-)
Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt
Chiết tách plasmid
Tinh sạch Đoạn DNA
Cắt plasmid bằng HindIII Blunt - end
Tinh sạch
Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp
Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh
Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng
Chiết tách plasmid
Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7
3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E. coli DH5α trên môi trƣờng LB
Từ dòng vi khuẩn E. coli DH5α gốc hút 20µl dịch vi khuẩn sang ống nghiệm có chứa môi trƣờng LB lỏng.
Đem nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút trong vòng 36-48h.
Hút 1ml dịch vi khuẩn sau khi đã nuôi cấy vào ống eppendorf 1.5ml, thêm 150µl glycerol 98% vào và cất ống eppendorf vào tủ âm 70 để giữ giống.
Dịch còn lại tiếp tục cấy sang các ống nghiệm để chuẩn bị tế bào khả nạp.
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Bƣớc 1: Hút 20µl dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng. Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc trong vòng 3-4 giờ.
Bƣớc 3: Chuyển ống nghiệm chứa vi khuẩn vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút.
Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này đến khi hết dịch nuôi cấy.
Bƣớc 6: Cho 1ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa.
Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150µl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên.
Thêm 20µ glycerol vào và trữ ở -700C.
Khả nạp đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -700C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng.
3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Chúng tôi tiến hành biến nạp theo 3 qui trình sau. Lƣợng DNA không lớn hơn 50ng trong một thể tích là 10μl hoặc ít hơn.
Quy trình 1
- Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
- Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
- Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
- Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng.
Quy trình 2
- Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây.
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
- Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl (đã pha loãng ½) dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
-Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
- Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng.
Quy trình 3
Lập lại quy trình 2 nhƣng không pha loãng khi hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X- gal, IPTG.
3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 3.4.6.1 Chiết tách plasmid 3.4.6.1 Chiết tách plasmid
Có nhiều phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid nhƣ: Phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ cao, phƣơng pháp SDS – kiềm. Nhƣng chúng tôi chọn phƣơng pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng tế bào bị vỡ , dƣới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh đƣợc sự phân hủy của DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính. Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng. DNA của bộ gen có kích thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid. Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống. Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen. DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng.
Phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau:
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200
C
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Cho 150μl dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
Bƣớc 4: Thêm 200μl dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm tiếp 150μl dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ.
Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200C trong 1 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa.
Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà
thêm vào.
Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách.
Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasmid đối chứng.
Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym
EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA plasmid chiết tách đƣợc có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không.
Qui trình li trích plasmid sử dụng AurumTM Plasmid Mini Kit (Bio-Rad) Thành phần của AurumTM
Plasmid Mini Kit
Resuspension solution (dung dịch hòa tan) Lysis solution (dung dịch phân giải)
Neutralization solution (dung dịch trung hòa) Wash solution (dung dịch rửa)
Elution solution (dung dịch tách rửa) Plasmid mini columns 100 2ml capless wash tubes 100
Vi khuẩn sau khi tăng sinh trong môi trƣờng LB lỏng (theo tỉ lệ 1:20) trong vòng 16 giờ hoặc xác định mật độ tế bào bằng cách đo OD ở bƣớc sóng 600 nm đến khi OD600= 6.
Bƣớc 1: Chuyển dịch vi khuẩn đã nuôi cấy vào ống eppendorf (1.5-2.0ml). Li tâm trong 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C. Loại bỏ dịch nổi bằng việc gạn hay hút.
Bƣớc 2: Thêm 250µl dung dịch resuspension và vortex hoặc hút lên hút xuống đến khi cặn tế bào tan hoàn toàn.
Bƣớc 3: Thêm 250µl dung dịch lysis và trộn bằng cách đảo ngƣợc eppendorf nhanh, mạnh 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Dung dịch sẽ trở nên nhớt và mỏng.
Bƣớc 4: Thêm tiếp 350µl dung dịch neutralization và trộn bằng cách đảo ngƣợc eppendorf 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Kết tủa đã đƣợc hình thành.
Bƣớc 5: Li tâm trong vòng 5 phút 13000 vòng/phút ở 40C hỗn hợp trên. Cặn đặc trắng sẽ hình thành dọc theo cạnh hoặc dƣới đáy của ống eppendorf. Dịch nổi chứa DNA plasmid.
Bƣớc 6: Trong khi li tâm, chèn 1 cột plasmid mini column vào ống capless