phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Chúng tôi tiến hành biến nạp theo 3 qui trình sau. Lƣợng DNA không lớn hơn 50ng trong một thể tích là 10μl hoặc ít hơn.
Quy trình 1
- Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
- Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
- Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
- Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng.
Quy trình 2
- Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây.
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
- Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl (đã pha loãng ½) dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
-Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
- Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng.
Quy trình 3
Lập lại quy trình 2 nhƣng không pha loãng khi hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X- gal, IPTG.