DC1 EcoRV 1 DC2 EcoRV 2
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1)
(DC1) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 1) sản phẩm cắt đươc bằng enzyme EcoRV; (DC2) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 2) sản phẩm không cắt được bằng EcoRV.
DNA plasmid
3.0kb
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1%
Kết quả ở hình trên cho thấy plasmid đã cắt hoàn toàn đúng kích thƣớc, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhƣng chỉ có sản phẩm tách chiết plasmid ở mẫu đối chứng 1 là đƣợc cắt. Do đó chúng tôi tiến hành phản ứng cắt lần 2 để kiểm tra hoạt tính cắt của enzyme EcoRV thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Mẫu (1) và (2) sản phẩm tách chiết plasmid đã không bị cắt bởi enzyme EcoRV trong khi mẫu (3), (4) đƣợc cắt hoàn toàn.
Vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản phẩm tách chiết có phải là plasmid mong muốn hay không thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
DC DC
1 2
Hình 4.9Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1%
(1), (2): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid.
DC DC
1 2 3
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1%
(1), (2), (3): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid.
DC 1 2 3 4
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2)
(DC): sản phẩm đã cắt bằng EcoRV ở lần 1; (1), (2): sản phẩm cắt bằng EcoRV; (3), (4): sản phẩm cắt bằng RsaI.
Plasmid đã cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kích thƣớc của plasmid đối chứng. Do đó có thể suy ra rằng, trong quá trình làm thí nghiệm plasmid đã bị hƣ site cắt EcoRV trên vùng MCS hoặc enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên không thể nhận biết đƣợc vị trí site cắt EcoRV trên vùng MCS.
Vì vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi quyết định chọn sản phẩm cắt bằng HindIII, phủ đầu bằng để thực hiện phản ứng nối.
Một số điều cần chú ý khi thực hiện phản ứng cắt
RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cất trở lại vào -200C.
Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme.