Từ dòng vi khuẩn E. coli DH5α gốc hút 20µl dịch vi khuẩn sang ống nghiệm có chứa môi trƣờng LB lỏng.
Đem nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút trong vòng 36-48h.
Hút 1ml dịch vi khuẩn sau khi đã nuôi cấy vào ống eppendorf 1.5ml, thêm 150µl glycerol 98% vào và cất ống eppendorf vào tủ âm 70 để giữ giống.
Dịch còn lại tiếp tục cấy sang các ống nghiệm để chuẩn bị tế bào khả nạp.
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Bƣớc 1: Hút 20µl dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng. Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc trong vòng 3-4 giờ.
Bƣớc 3: Chuyển ống nghiệm chứa vi khuẩn vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút.
Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này đến khi hết dịch nuôi cấy.
Bƣớc 6: Cho 1ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa.
Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150µl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên.
Thêm 20µ glycerol vào và trữ ở -700C.
Khả nạp đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -700C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng.