3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA
Các bƣớc tinh sạch DNA bằng RNAse nhƣ sau:
- Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nƣớc vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) - Thêm vào 2 l RNAse vào hỗn hợp trên
- Ủ ở 370C khoảng 30 giây
- Thêm vào 2 l Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) - Ly tâm lấy phần trên sang ống khác
- Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút - Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên
- Làm khô DNA và cho vào TE - Điện di và đọc kết quả
Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel.
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel
Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di
Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV.
Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc).
Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10mg gel ≈ 10µl capture buffer.
Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút).
Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch. Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf.
Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40C.
Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C.
Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX. Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp lại. Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel
agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch.
3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX
Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch.
Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản phẩm PCR là 5:1.
Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40
C.
Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.
Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi.
Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại.
Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả tinh sạch.
3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR
Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow).
Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA
Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau:
NEbuffer 10X 2µl
DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg)
dNTPs (33µmol) 1µl
DNA fragment Klenow 1 unit (1µl)
Thêm nƣớc cho tới 20µl
Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút.
Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid
Plasmid sau khi cắt bằng HindIII, và thực hiện phản ứng phủ đầu bằng theo qui trình sau: NEbuffer 10X 2µl DNA plasmid 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl Phản ứng tạo đầu bằng Đầu dính Đầu bằng
DNA fragment Klenow 1 unit (1µl)
Thêm nƣớc cho tới 20µl
Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút
3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) nối blunt-end)
T4 DNA ligase không giống nhƣ E. coli DNA ligase, nó có thể xúc tác phản ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym ligase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10.
Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng ligation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ ligase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra.
Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn
(ng)DNA chèn =
Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng DNA cần sử dụng
Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau:
T4 reaction buffer 1µl
DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng)
DNA plasmid 1µl (50ng)
T4 ligase 1 unit
Thêm nƣớc cho tới 10µl
Ủ phản ứng ở 160C qua đêm, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer.
Vector (ng) x DNA chèn (kb) Vector (kb)
Tỉ lệ DNA chèn (bp)
Vector X
3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa)
Thực hiện biến nạp theo quy trình sau:
- Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút.
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
- Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
- Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt.
- Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ).
- Quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri, bắt những khuẩn lạc trắng cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ.
Thực hiện biến nạp theo quy trình trên plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng. Bắt những khuẩn lạc xanh cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
Hình 4.1Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5
(A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 10:1.5 phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100 µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C.
C
Hình 4.2Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5
(A)Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1giờ, cấy 10 µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X- gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (D) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200 µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X- gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370
C.
A B
Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 2 (ở thể tích biến nạp là 3:0.5, và dịch biến nạp đã pha loãng ½ khi trang lên đĩa) cho kết quả tốt hơn chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 1 (ở thể tích biến nạp 3:0.5, và dịch biến nạp không pha loãng khi trang lên đĩa) và chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 3 (ở thể tích biến nạp là 10:1.5).
Biến nạp theo quy trình 1 cho kết quả chỉ vài khuẩn lạc xanh xuất hiện và có rất nhiều khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng. Điều này có thể giải thích là do trong quá trình làm thí nghiệm đã có một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh hoặc là do thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa nên các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân hủy vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng hoặc tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen LacZ diễn ra chậm (đối với khuẩn lạc này khi quan sát kỹ sẽ thấy màu xanh nhạt).
Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1. Nhƣ vậy cho thấy quy trình 2 hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp nhƣ vậy là hợp lí. Khuẩn lạc mọc rời rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh khối để li trích đƣợc plasmid.
Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2. Khuẩn lạc xanh tuy nhiều nhƣng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng.
Nhƣ vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng LB agar/Amp/X- gal/IPTG chúng tôi thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp.
4.2 Tách chiết DNA plasmid. 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid
Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Kết quả tách chiết plasmid lần 1 còn lẫn rất nhiều DNA của genome vi khuẩn. Có thể điều này là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính.
Với nhận định trên tôi đã tiến hành tách chiết plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Nhờ khắc phục những sai sót của lần 1 kết quả của lần tách chiết này cho thấy đã loại đƣợc DNA của genome, thu đƣợc plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hóa chất sử dụng đơn giản. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. DNA genome DNA plasmid 3.0kb Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1)
DNA plasmid
3.0kb Hình 4.4 Sản phẩm tách
chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2)
Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid
Khi thêm dung dịch II chỉ đảo ngƣợc eppendorf khoảng 5-6 lần sau đó phải thêm dung dịch III ngay để trung hòa dung dịch II.
Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen.
Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới.
4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM
Plasmid Mini Kit
Tách chiết plasmid bằng Kit cho hiệu quả tách chiết cao hơn, lƣợng plasmid thu đƣợc nhiều hơn, tinh sạch hơn, thao tác đơn giản, nhanh. Sản phẩm tách chiết không cần phải qua bƣớc tinh sạch để sử dụng cho các bƣớc tiếp theo trong quá trình cloning.
4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV
DC1 EcoRV 1 DC2 EcoRV 2
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1)
(DC1) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 1) sản phẩm cắt đươc bằng enzyme EcoRV; (DC2) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 2) sản phẩm không cắt được bằng EcoRV.
DNA plasmid
3.0kb
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1%
Kết quả ở hình trên cho thấy plasmid đã cắt hoàn toàn đúng kích thƣớc, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhƣng chỉ có sản phẩm tách chiết plasmid ở mẫu đối chứng 1 là đƣợc cắt. Do đó chúng tôi tiến hành phản ứng cắt lần 2 để kiểm tra hoạt tính cắt của enzyme EcoRV thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Mẫu (1) và (2) sản phẩm tách chiết plasmid đã không bị cắt bởi enzyme EcoRV trong khi mẫu (3), (4) đƣợc cắt hoàn toàn.
Vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản phẩm tách chiết có phải là plasmid mong muốn hay không thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
DC DC
1 2
Hình 4.9Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1%
(1), (2): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid.
DC DC
1 2 3
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1%
(1), (2), (3): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid.
DC 1 2 3 4
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2)
(DC): sản phẩm đã cắt bằng EcoRV ở lần 1; (1), (2): sản phẩm cắt bằng EcoRV; (3), (4): sản phẩm cắt bằng RsaI.
Plasmid đã cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kích thƣớc của plasmid đối chứng. Do đó có thể suy ra rằng, trong quá trình làm thí nghiệm plasmid đã bị hƣ site cắt EcoRV trên vùng MCS hoặc enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên không thể nhận biết đƣợc vị trí site cắt EcoRV trên vùng MCS.
Vì vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi quyết định chọn sản phẩm cắt bằng HindIII, phủ đầu bằng để thực hiện phản ứng nối.
Một số điều cần chú ý khi thực hiện phản ứng cắt
RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cất trở lại vào -200C.
Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme.
4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA
Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào