4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA
Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA sau đó tinh sạch đoạn DNA trên.
Kết quả điện di cho thấy quá trình tinh sạch đã loại hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel.
Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzyme Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể kiểm tra khi đã chèn vào đƣợc plasmid và biến nạp vào vi khuẩn.
Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar).
Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer.
4.4.2 Tinh sạch plasmid
Plasmid sau khi dùng enzyme HindIII cắt mở vòng mới tinh sạch.
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm.
Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX
(1), (2): sản phẩm PCR kích thước 900bp; (3): ladder 100bp.
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX
(1): sản phẩm PCR kích thước 223bp; (2), (3): sản phẩm PCR kích thước 900bp.
Từ sản phẩm trên tiến hành phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid và tinh sạch lại bằng qui trình tinh sạch sử dụng RNAse.
Sau đó tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối.
4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp
Thực hiện phản ứng phủ đầu bằng cho sản phẩm PCR và plasmid sau khi cắt
HindIII, tinh sạch sản phẩm, nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid. Biến nạp plasmid đã nối này vào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp,và thực hiện tƣơng tự với plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Cả hai trƣờng hợp biến nạp đọan DNA 900bp và 223bp đều cho toàn khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng LB agar/Amp/X-gal/IPTG.
TS DC
Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1%
(DC) plasmid cắt bằng HindIII chưa tinh sạch; (TS) plasmid cắt bằng HindIII tinh sạch bằng cột GFX.
Hình 4.13 Biến nạp plasmid tái tổ hợp
(A) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 223bp; (B) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 900bp; (C) Biến nạp plasmid chưa tái tổ hợp.
C
Kết quả trên có thể là đã biến nạp hoàn toàn plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn hoặc những khuẩn lạc màu trắng trên là do các tế bào vi khuẩn bị đột biến kháng kháng sinh tạo thành.
Còn trên đĩa đối chứng xuất hiện cả khuẩn lạc màu xanh và trắng.
4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Chọn lọc những khuẩn lạc trắng, mọc rời rạc cấy sang môi trƣờng LB lỏng/ampicillin (60µg) nhân sinh khối qua đêm tiến hành tách chiết theo qui trình ở mục 3.4.6.1. Chạy điện di chỉ thu đƣợc toàn genome của vi khuẩn.
Còn kết quả li trích plasmid của khuẩn lạc xanh trên đĩa đối chứng thì thu đƣợc DNA plasmid.
Nhƣ vậy biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α chƣa thành công. Điều này có thể là do nồng độ plasmid sau khi cắt và nối sử dụng để biến nạp là chƣa phù hợp, vì chúng tôi đã không thể tính toán đƣợc nồng độ plasmid hao hụt sau khi thực hiện phản ứng cắt và nối. Hoặc cũng có thể thời gian sốc nhiệt quá ngắn nên plasmid không thể biến nạp vào tế bào vi khuẩn.
Do đó, trong quá trình phủ đầu bằng cho đoạn DNA và plasmid phải luôn chú ý cẩn thận tính toán các thành phần trong phản ứng cho phù hợp. Còn trong quá trình thiết lập phản ứng nối phải chú ý đến việc tính toán tỉ lệ thể tích giữa vector và đoạn DNA, nhiệt độ ủ của phản ứng sao cho phù hợp và nên thêm các chất xúc tác cho phản ứng nối nhƣ: PEG hay Hexamminecobalt chloride. Biến nạp vào vi khuẩn nên sốc nhiệt ở thời gian lâu hơn, thử nghiệm nhiều qui trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt và kèm theo đối chứng.
Vì thời gian giới hạn chúng tôi đã không thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau nên đã không cho ra đƣợc kết quả nhƣ mong muốn.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
Qua quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: - Hoàn thiện quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phƣơng pháp hóa học, tế bào khả nạp có thể tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng.
- Hoàn thiện đƣợc quy trình biến nạp plasmid pBluescript SK(+/-) vào vi khuẩn
E. coli DH5α và chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng chứa Ampicillin/X-gal/IPTG. - Đã đƣa ra quy trình tách chiết plasmid chuẩn bằng phƣơng pháp SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ.
Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200
C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200
C trong 1 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa.
Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà
thêm vào.
Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách.
- Đã thiết lập đƣợc phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn để kiểm tra kết quả tách chiết.
5.2 Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện các quy trình cắt bằng HindIII, nối đoạn DNA từ phản ứng PCR vào plasmid pBluescript SK(+/-) và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α.
- Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm nối giữa plasmid pBluescript SK(+/-) đã cắt bằng HindIII và đoạn DNA từ phản ứng PCR, giải trình tự sản phẩm nối trên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.
2. Lê Đình Lƣợng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật.
3. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh
và Cao Cƣờng, 2002, Công nghệ gen, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005, Sinh học phân tử - Giới thiệu phương
pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM.
5. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005, Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α, Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
6. Phạm Thành Hổ, 8-2003, Di truyền học, NXB Giáo Dục.
7. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp và Nguyễn Thúy Hƣơng, 1999, Vi sinh vật học đại cương, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
8. Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo và Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM 29 trang.
Tài liệu tiếng nƣớc ngoài.
9. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall.
10.Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan.
11.Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH.
12.Sambrook J, E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH.
13.Wolgang Schumann, 1995, Genetic Engineering Techniques.
Các website
http://www.protocol-online.org/prot/Mmolecular_Biology/ http://brahms.chem.uic.edu/~cgpage/protocol/cloning.html
http://core.eai.edu/biol/foruvellm/farwelebpage/Biotech3100/pvector.200.pfd
PHỤ LỤC
1. Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm
Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng
Trytone 10g
Bacto yeast extract 5g
Natrichlorua (NaCl) 10g
Thêm nƣớc cho tới 1000 ml
Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút Môi trƣờng LB agar
Trytone 10g
Bacto yeast extract 5g
Natrichlorua (NaCl) 10g
Agar 15g
Thêm nƣớc cho tới 1000 ml
Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút. Môi trƣờng LB + Ampicillin
Trytone 10g
Bacto yeast extract 5g
Natrichlorua (NaCl) 10g
Agar 15g
Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210
c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 100µg/ml
Môi trƣờng LB + Ampicillin + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coli)
Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillin, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch
2. Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid Dung dịch I
Tris – HCl 25mM pH8
Glucose 50mM
EDTA 10mM
Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng)
Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl
NaOH 5N 40µl Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25%
Glycerol trong TAE 1X 40%
Dung dịch Lysozyme:
Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0.
Dung dịch X-gal 20mg/ml
Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác)
Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock)
Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,2μm
Dung dịch kháng sinh Ampicillin 100mg/ml
Cân 100mg ampicillin dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,45μm.
3. Các loại buffer
Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt)
Tris-HCl 100mM
NaCl 1M
MgCl2 50mM
2-Mercaptoethanol 10mM
NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment)
NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM Ligation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM ATP 660μM