4.2.1 Tách chiết DNA plasmid
Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Kết quả tách chiết plasmid lần 1 còn lẫn rất nhiều DNA của genome vi khuẩn. Có thể điều này là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính.
Với nhận định trên tôi đã tiến hành tách chiết plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Nhờ khắc phục những sai sót của lần 1 kết quả của lần tách chiết này cho thấy đã loại đƣợc DNA của genome, thu đƣợc plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hóa chất sử dụng đơn giản. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. DNA genome DNA plasmid 3.0kb Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1)
DNA plasmid
3.0kb Hình 4.4 Sản phẩm tách
chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2)
Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid
Khi thêm dung dịch II chỉ đảo ngƣợc eppendorf khoảng 5-6 lần sau đó phải thêm dung dịch III ngay để trung hòa dung dịch II.
Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen.
Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới.
4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM
Plasmid Mini Kit
Tách chiết plasmid bằng Kit cho hiệu quả tách chiết cao hơn, lƣợng plasmid thu đƣợc nhiều hơn, tinh sạch hơn, thao tác đơn giản, nhanh. Sản phẩm tách chiết không cần phải qua bƣớc tinh sạch để sử dụng cho các bƣớc tiếp theo trong quá trình cloning.