Người ta đã thừa nhận số lượng các loài vi khuẩn trong môi trường tự nhiên vượt xa số lượng các loài đã được phát hiện và mô tả. Trong một thời gian dài, sự đa dạng của vi sinh vật bị đánh giá thấp. Trong các mẫu môi trường khác nhau, số
lượng tế bào quan sát được qua kính hiển vi đã vượt xa số lượng tế bào vi khuẩn
được nuôi cấy theo nhiều quy mô khác nhau [38,74,136]. Các phương pháp trước
đây hầu như không thể mô tả được chính xác và đầy đủ các loài vi sinh vật này. Ngược lại, FISH đã đưa ra hình ảnh chi tiết của môi trường vi sinh mà không có bước làm sạch hay khuếch đại, nên nó đã được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau về môi trường. FISH đã được sử dụng trên toàn thế giới để
nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong tự nhiên như môi trường sống dưới nước, ví dụ như trầm tích biển Wadden [88], tại vịnh hẹp ở Na-uy [115], sinh vật phù du
ở sông hoặc biển [6,52,73,82], tuyết hồ trên núi cao [155], trong đất [37] và trên bề
mặt rễ thực vật [92]. Tuy nhiên, khi phân tích trên các mẫu môi trường vi mô phức tạp, sự tự phát huỳnh quang cần phải được hạn chế tối đa.
Một ví dụđiển hình là nghiên cứu của Felske năm 1998 _“phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà Lan”. Đây là một loại vi khuẩn hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA (ribotype có liên quan đến sự xác định dấu vết di truyền của DNA, chứa toàn bộ hoặc một phần các đoạn gen mã hóa cho phân tử
16S rRNA hoặc 23S rRNA; ribotype DA001 có trình tự 5’-CTTTGGGAGC
TTGCTCCCA-3’). Đầu tiên, vi khuẩn được chiết xuất từ đất, sau đó được cốđịnh và tiền xử lý cho quá trình lai tại chỗ. Quá trình lai được thực hiện trong dung dịch
đệm (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2) với sự
hiện diện của formamide 20%, 5 lần thể tích chất phản ứng Denhardt, 10 pmol đầu dò oligonucleotide REX72 (5’-TGGGAGCAAG CTCCCAAAG-3’), và 10pmol
đầu dò LGC353b (5’-GCGGAAGATT CCCTACTGC-3’) ở 45oC trong 4h. Sau
khi lai, dung dịch được ủ với hai lần dung dịch đệm ở 45oC trong 20 phút, và rửa sạch bằng nước khử ion và sấy khô. Sau đó nhuộm với dung dịch chứa 1mg 4,6-
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 20
diamidino-2-phenylindole (DAPI) trên mỗi ml dung dịch (630 mM NaCl, 10mM
Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2). Những tín hiệu huỳnh quang khi
quan sát trên vi khuẩn trong đất tương đối không ổn định so với tín hiệu quan sát trên các môi trường trong phòng thí nghiệm. Sử dụng một đầu dò huỳnh quang duy nhất đã không mang lại kết quả thuyết phục. Do tín hiệu từ các hạt đất không chứa vi khuẩn cao, nên rất khó để chứng minh sự khác biệt giữa các tín hiệu đặc trưng và các tín hiệu nhiễu. Đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang tạo ra tín hiệu yếu màu xanh lá cây tương phản lại màu nền từ xanh lục sẫm đến nâu sẫm do các đầu dò không đặc trưng và sự tự phát huỳnh quang của các hạt đất. Vì vậy, chúng tôi sử
dụng ba chất huỳnh quang có màu sắc khác nhau nhằm tăng cường tín hiệu và đưa ra sự tương phản màu sắc giữa các tế bào mục tiêu với nền. Đầu tiên DAPI, một thuốc nhuộm huỳnh quang của DNA, được sử dụng để nhận biết tất cả các vi sinh vật với tín hiệu màu xanh. Trong thí nghiệm, DAPI đã dò tìm được khoảng 108 loại vi khuẩn trên mỗi gam đất. Thứ hai, các đầu dò LGC252b sẽ được nhuộm với Cy3 để phát hiện các tế bào vi khuẩn Bacillus và bào tử với tín hiệu màu đỏ của nó (màu đỏ tía khi nó bổ sung với các tín hiệu màu xanh của DAPI). Khoảng 40% các hạt phát hiện bởi DAPI cũng được phát hiện bởi LGC353b; các hạt này chủ yếu là có cấu trúc hình cầu, có đường kính nhỏ hơn 1µm và đôi khi phân bố thành cụm (Hình 6a). Các điểm đánh dấu lần thứ ba mang tính đặc hiệu rất cao, đó là sự liên kết giữa các đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang với các ribotype DA001 của
Bacillus. Với phương pháp nhuộm nhiều lần này, các tế bào có chứa ribotype
DA001 cần phải có được màu xanh của DAPI trên DNA, màu đỏ của LGC353b
trên các trình tự đích đặc hiệu trong rRNA 16S của Bacillus, và màu xanh lá cây của đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang trên các đoạn ribotype. Vì ánh sáng màu xanh, đỏ và xanh lá cây hòa vào nhau sẽ tạo ra ánh sáng trắng (Hình 6b), nên các tế
bào có chứa DA001 sẽ mang ánh sáng trắng mà được phân biệt rõ ràng từ các tín hiệu nền và vi khuẩn khác. Trong một số trường hợp, khi quan sát có thể thấy các tín hiệu là các dấu chấm, các tín hiệu này có thể là bào tử hoặc có thể là các tế bào
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 21
Mặc dù các tế bào lai với đầu dò REX72 rất nổi bật và phong phú, nhưng các nhà nghiên cứu vẫn gặp phải những vấn đề khi dò tìm các tín hiệu tích cực. Để giải quyết điều này, các nhà nghiên cứu phải điều chỉnh nồng độ của vi khuẩn giống như của các hạt trong huyền phù. Khi các mẫu vi khuẩn từđất được pha loãng dưới 200 lần (sau khi ly tâm), các nhà nghiên cứu không thể phát hiện được các tín hiệu tích cực trong tất cả các tín hiệu huỳnh quang có màu sáng. Khi mẫu chuẩn bị đã
được pha loãng hơn 1000 lần, số lượng các tín hiệu là quá thấp cho các tài liệu hình
ảnh đại diện. Điều này tương ứng với phạm vi pha loãng vào khoảng 103 đến 104 vi khuẩn trên 1µl.
Kết quả thu được đã chỉ ra rằng ribotype DA001 thực sự có nguồn gốc từ một trong những chủng vi khuẩn chiếm đa số trong đất ở đồng cỏ Drentse A (Hà Lan). Hình ảnh và kích thước của các tín hiệu tích cực cho thấy rằng các tế bào dinh dưỡng Bacillus ribotype DA001 có tồn tại. Tuy nhiên, đến bây giờ những nỗ lực của các nhà nghiên cứu nhằm nuôi cấy được loài Bacillus này vẫn chưa thành công.
FISH không những cung cấp hình ảnh chụp nhanh trong từng thời điểm nhất
định mà còn được sử dụng để kiểm soát các mạng lưới vi khuẩn trong dòng chảy liên tục của trầm tích nước biển [22], trong suốt quá trình thay đổi theo mùa của hồ
núi cao [108] và thành phần các sinh vật phù du đáp ứng lại với sự gia tăng thảm sinh vật nguyên sinh [64]. Hơn nữa, những loài vi sinh vật hoang hóa hoặc mới
được định danh gần đây trong ngành vi khuẩn đã được phát hiện bằng cách sử
dụng FISH, như các chủng của loài Holophaga/Acidobacterium [90], một chủng
Bacillus hoang trong đất đồng cỏ Hà Lan [37], và gần đây là chủng Aquabacterium
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 22
Hình 5. Kết quả hiển thị cho quá trình lai. (a)Phát hiện các vi khuẩn Bacillus ribotype DA001 với ba chất nhuộm khác nhau trên một mẫu đất trích ly được pha loãng 320 lần. Độ phóng đại 1200 lần. (b)màu sắc dự kiến của ba chất nhuộm trên lý thuyết. (c)Phản ứng của đầu dò LGC353b với một mẫu cốđịnh của B.cereus riêng rẽ nhằm chứng minh tính thấm của các bào tử. Độ phóng đại 1600 lần. (d)Thuốc nhuộm DAPI [37].
Tất cả những nghiên cứu này có một ý nghĩa to lớn đối với sự hiểu biết về thành phần và môi sinh của cộng đồng vi khuẩn tự nhiên và động lực quần thể của chúng
để phản ứng lại những tác động của tự nhiên và loài người.