Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền như :
¾ Việc chẩn đoán trước sinh và sau sinh những bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể của thai nhi.
¾ Phát hiện các mất đoạn nhỏở một số hội chứng di truyền. ¾ Xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc.
¾ Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thểđặc hiệu trong ung thư.
Việc phát triển kỹ thuật FISH ở Việt Nam trong tương lai có nhiều triển vọng vì
đầu tư cho kỹ thuật này phù hợp với điều kiện kinh tế và khoa học kỹ thuật của nước ta. Thứ nhất, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một kỹ thuật đơn giản, thời gian thực hiện ngắn và kết quả thu được rất chính xác, đồng thời phạm vi ứng dụng rất rộng. Thứ hai, đối với các phòng thí nghiệm nhỏ không có đầy đủ các thiết bị
kỹ thuật cũng như trang bị riêng cần thiết cho các kỹ thuật khuếch đại phân tử di truyền có thể áp dụng phương pháp thay thế như lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) mà có thể kết hợp dễ dàng để lai tạo phân tử với kính hiển vi có trang bị hệ thống lọc đa sắc, một kỹ thuật quen thuộc với những người nghiên cứu vi sinh. Ngược lai,
đối với các bệnh viện lớn hay các phòng thí nghiệm tiêu chuẩn với số lượng mẫu rất lớn yêu cầu phải có sự kiểm nghiệm cho hiệu quả cao, và FISH là một giải pháp tốt nhất [141].
CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN
http://www.ebook.edu.vn 37
Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổđiển.
CHƯƠNG 7. TỔNG KẾT
http://www.ebook.edu.vn 38
CHƯƠNG 7. TỔNG KẾT
Lai huỳnh quang tại chỗ FISH là kỹ thuật dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai với các trình tựđích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn mà không phá vỡ tế bào.
Thực hiện thí nghiệm FISH bao gồm 5 bước cơ bản sau : chuẩn bị mẫu và đầu dò, cố định mẫu, lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào, rửa mẫu, và quan sát.
Đầu dò là 1 đoạn oligonucleotide dài khoảng 15 đến 30 bp, việc lựa chọn đầu dò dựa vào trình tự đích đặc hiệu đối với mỗi loài vi sinh vật, thường dùng là đoạn 16S
rRNA. Một số trình tự đích khác như 18S rRNA, 23S rRNA hay mRNA cũng được
dùng thành công cho FISH. Việc lựa chọn đầu dò trong FISH phải xem xét tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng xâm nhập vào trong tế bào.
Nếu sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang trực tiếp thì sau quá trình lai không phải qua bước dò tìm. Mỗi thuốc nhuộm huỳnh quang có khả năng phát xạở mỗi bước sóng
khác nhau cho màu sắc khác nhau.
Tế bào trước khi thực hiện quá trình lai cần phải được xử lý với hóa chất thích hợp
để tăng tính thấm của màng tế bào, thường sử dụng là formadehyde, paraformadehyde hay ethanol. Đối với vi khuẩn Gram dương cần có biện pháp xử lý lớp vỏ chứa peptidoglycan.
Quá trình lai được thực hiện trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ từ 37 đến 50oC. Sau quá trình lai tiến hành rửa bỏ các đầu dò không liên kết và các chất bẩn khác.
Việc quan sát hình ảnh được thực hiện bởi kính hiển vi có trang bị một bộ lọc dải hẹp nhiều lần. Ngoài ra có thể sử dụng kính hiển vi quét laze đồng tiêu (CLSM) hay quan sát tín hiệu phát ra bằng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy.
CHƯƠNG 7. TỔNG KẾT
http://www.ebook.edu.vn 39
Kết quả thí nghiệm FISH có thể bị ảnh hưởng bởi các nguyên nhân sau : mẫu có chứa chất tự phát huỳnh quang, đầu dò thiếu tính đặc hiệu, số lượng đầu dò sử dụng quá ít, 1 số trình tựđích có cấu trúc quá phức tạp, hàm lượng rRNA thấp, ảnh chụp bị
mất màu.
Hiện nay trên thế giới FISH được sử dụng trong việc mô tả sựđa dạng của thế giới vi sinh vật, phát hiện hệ vi sinh vật trong nước thải, phát hiện vi khuẩn cộng sinh, chẩn
đoán hệ vi khuẩn phức tạp, phát hiện mầm bệnh có trong các mô cấy và dụng cụ vô trùng, phát hiện nấm, thuốc thú y, chẩn đoán các mầm bệnh ở thực vật, phát hiện các mầm bệnh bằng phương pháp lai không sử dụng chất huỳnh quang.
Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở
nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn
đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổđiển.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Thắng, P.C & Hoàng, B.V.M., 2004. Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trên nhân tế bào gian kỳ để phát hiện nhanh bất thường nhiễm sắc thể
thường gặp trong chẩn đoán trước sinh. Chuyên đề Hội nghị Khoa học kỹ thuật Bệnh viện Bình Dân, pp. 1-5.
[2] Nhung, Đ.T.H., Ngọc, N.D., Lan, A.T., 2008. Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang tại chỗ trong phát hiện bất thường tại chỗ trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Tạp chí nghiên cứu y học, 57, 57-62. [3] Hương, T.T.T., Lan, H.T., Lan, T.T.N., Cường, T.D., 2005. Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để chẩn đoán trước sinh hội chứng down. Tạp chí y học thực hành, 11, 9-11.
[4] Hương, T.T.T., Lan, H.T., Lan, T.T.N., Cường, T.D., Thơ,N.T.Q., 2006. Chẩn
đoán trước sinh hội chứng Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối. Tạp chí nghiên cứu y học, 1, 4-8.
[5] Albrecht-Buehler, G., 1996. Autofluorescence of live purple bacteria in the near infrared. Exp. Cell Res. 236, 43–50.
[6] Alfreider, A., 1996. Community analysis of the bacterial assemblages in the winter cover and pelagic layers of a high mountain lake by in situ hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2138–2144.
[7] Amann, R., 1990a. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl. Environ. Microbiol. 56, 1919–1925.
[8] Amann, R., 1990b. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172, 762–770.
[9] Amann, R., 1991. Identification in situ and phylogeny of uncultured bacterial endosymbionts. Nature 351, 161–164.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 41
[10] Amann, R.I., 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143–169. [11] Amann, R., 1996. In situ visualization of high genetic diversity in a natural
microbial community. J. Bacteriol. 178, 3496–3500.
[12] Ardern, E., 1914. Experiments of the oxidation of sewage without the aid of filters. J. Soc. Chem. Ind. 33, 523–539.
[13] Arnoldi, J., 1992. Species specific assessment of Mycobacterium leprae in
skin biopsies by in situ hybridization and polymerase chain reaction. Lab. Invest. 66, 618–623.
[14] Beimfohr, C.A., 1993. In situ identification of lactococci, enterococci and streptococci. Syst. Appl. Microbiol. 16, 450–456.
[15] Beutler, A.M., 1995. Case report: in situ hybridization for detection of inapparent infection with Chlamydia trachomatis in synovial tissue of a patient with Reiter’s syndrome. Am. J. Med. Sci. 310, 206–213.
[16] Bhatia, U., 1997. Dealing with database explosion: a cautionary note. Science 276, 1724–1725.
[17] Bidnenko, E., 1998. Estimation of the state of the bacterial cell wall by fluorescent in situ hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 64, 3059–3062. [18] Bond, P.L., 1999. Identification of some of the major groups of bacteria in
efficient and nonefficient biological phosphorus removal activated sludge systems. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4077 4084.
[19] Boye, M., 1998. Specific detection of the genus Serpulina, S. hyodysenteriae
and S. pilosicoli in porcine intestines by fluorescent rRNA in situ hybridization. Mol. Cell. Probes 12, 323–330.
[20] Brown-Howland, E.B., 1992. Development of a rapid method for detecting bacterial cells in situ using 16S rRNA-targeted probes. BioTechniques 13, 928– 933.
[21] Brown,V.I., 1996. Use of an improved cetrimide agar medium and other
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 42
[22] Bruns, A., 1998. In situ detection of bacteria in continuous-flow cultures of seawater sediment suspensions with fluorescently labelled rRNA-directed oligonucleotide probes. Microbiology 144, 2783–2790.
[23] Capodieci, P., 1998. Automated in situ hybridization: diagnostic and research applications. Diagn. Mol. Pathol. 7, 69–75.
[24] Choi, B.-K., 1994. Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructive periodontitis. Infect. Immun. 62, 1889– 1895.
[25] Christensen, B.B., 1998. Establishment of new genetic traits in a microbial biofilm community. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2247–2255.
[26] Corey, D.R., 1997. Peptide nucleic acids: expanding the scope of nucleic acid recognition. Tibtech 15, 224–229.
[27] Cullander, C., 1999. Fluorescent probes for confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 122, 59–73.
[28] Daims, H., 1999. The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all bacteria: development and evaluation of a more comprehensive probe set. Syst. Appl. Microbiol. 22, 434–444.
[29] DeLong, E.F., 1989. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells. Science 243, 1360–1363.
[30] DeLong, E.F., 1999. Visualization and enumeration of marine planctonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluores cent in situ hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 65, 5554 5563.
[31] Deere, D., 1998. Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of
Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization. Lett. Appl. Microbiol. 27, 352–356.
[32] Drobniewski, F.A., 2000. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis
complex and nontuberculous mycobacterial liquid cultures by using peptide nucleic acidfluorescence in situ hybridization probes. J. Clin. Microbiol. 38, 444–447.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 43
[33] Eberl, L., 1997. Use of green fluorescent protein as a marker for ecological studies of activated sludge communities. FEMS Microbiol. Lett. 149, 77–83. [34] Edelstein, P.H., 1985. Manual of Clinical Microbiology, 4th Edition.
American Society of Microbiology, Washington, DC, pp. 373–381.
[35] Erhart, R., 1997. Development and use of fluorescent in situ hybridization for
the detection and identification of Microthrix parvicella in activated sludge.
System. Appl. Microbiol. 20, 310–318.
[36] Favre-Bonte´, S., 1999. Klebsiella pneumoniae capsule expression is
necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infect. Immun. 67, 6152–6156.
[37] Felske, A., 1998. In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in
dutch grassland soils. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4588–4590.
[38] Ferguson, R.L., 1984. Response of marine bacterioplancton to differential filtration and confine ment. Appl. Environ. Microbiol. 47, 49–55.
[39] Forsgren, J., 1994. Haemophilus influenzae resides and multiplies
intracellularly in human adenoid tissue as demonstrated by in situ hybridization and bacterial viability assay. Infect. Immun. 62, 673–679.
[40] Forsgren, J., 1996. Persistence of nontypeable Haemophilus influenzae in
adenoid macrophages: a putative colonization mechanism. Acta Otolaryngol. (Stockh.) 116, 766–773.
[41] Franks, A.H., 1998. Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescence in situ hybridization with group-specific 16S rRNA- targeted oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 3336–3345. [42] Fredricks, D.N., 1996. Sequence-based identification of microbial pathogens:
a reconsideration of Koch’s postulates. Clin. Microbiol. Rev. 9, 18–33.
[43] Frischer, M.E., 1996. Differential sensitivity of 16S rRNA targeted oligonucleotide probes used for fluorescence in situ hybridization is a result of higher order structure. Can. J. Microbiol. 42, 1061–1071.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 44
[44] Fritsche, T.R., 1999. In situ detection of novel bacterial endosymbionts of
Acanthamoeba spp. phylogenetically related to members of the order
Rickettsiales. Appl. Environ. Microbiol. 65, 206–212.
[45] Fuchs, B.M., 1998. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of
Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4973–4982.
[46] Ge, N.-L., 1995. Detection of Anaplasma marginale DNA in bovine
erythrocytes by slot-blot and in situ hybridization with a PCRmediated digoxigenin-labeled DNA probe. J.Vet. Diagn. Invest. 7, 465–472.
[47] Gebhart, C.J., 1994. Specific in situ hybridization of the intracellular organism of porcine proliferative enteropathy. Vet. Pathol. 31, 462–467.
[48] Gersdorf, H., 1993a. Identification of Bacteroides forsythus in subgingival
plaque from patients with advanced periodontitis. J. Clin. Microbiol. 31, 941– 946.
[49] Gersdorf, H., 1993b. Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gram-negative an aerobes in subgingival plaque samples. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 6, 109–114.
[50] Ghiorse, W.C., 1996. Applications of laser scanning microscopy for analysis of aquatic microhabitats. Microsc. Res. Tech. 33, 73–86.
[51] Giovannoni, S.J., 1988. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells. J. Bacteriol. 170, 720–726. [52] Glockner, F.O., 1996. An in situ hybridization protocol for detection and
identification of planctonic bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 19, 403–406.
[53] Gobel, U.B., 1991. Targeting ribosomal RNA sequences: a universal approach to the detection and identification of microorganisms. In: Vaheri, A., Tilton, R.C., Balows, A. (Eds.), Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology. Springer, Heidelberg, pp. 27–36.
[54] Graf, B., 1998. Qualitative and quantitative analysis of autofluorescence in fungi. Mycoses 41, 39–46.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 45
[55] Graham, A.R., 1983. Fungal autofluorescence with ultraviolet illumination. Am. J. Clin. Pathol. 79, 231–234.
[56] Grimm, D., 1998. Specific detection of Legionella pneumophila: construction
of a new 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2686–2690.
[57] Harmsen, H.J., 1999 Comparison of viable cell counts and fluorescence in situ hybridization using specific rRNA-based probes for the quantification of human faecal bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 183, 125–129.
[58] Harmsen, H.J., 2000. Analysis of intestinal flora development in breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30, 61–67.
[59] Hogardt, M., 2000. Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. J. Clin. Microbiol. 38, 818–825.
[60] Jansen, G.J., 1999. Development and validation of an automated, microscopy- based method for enumeration ofgroups of intestinal bacteria. J. Microbiol. Methods 37, 215–221.
[61] Jansen, G.J., 2000. Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes. J. Clin. Microbiol. 38, 814–817. [62] Jensen, T.K., 2000. Scanning electron microscopy and fluorescent in situ
hybridization of experimental Brachyspira (Serpulina) pilosicoli infection in growing pigs. Vet. Pathol. 37, 22–32.
[63] John, H., 1969. RNA:DNA hybrids at the cytogenetical level. Nature 223, 582–587.
[64] Ju¨rgens, K., 1999. Morphological and compositional changes in a planktonic bacterial community in response to enhanced protozoan grazing. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1241–1250.
[65] Juretschko, S., 1998. Combined molecular and conventional analyses of
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 46
Nitrospira-like bacteria as dominant populations. Appl. Environ. Microbiol. 64, 3042–3051.
[66] Jurtshuk, R.J., 1992. Rapid in situ hybridization technique using 16S rRNA segments for detecting and differentiating the closely related gram-positive
organisms Bacillus polymyxa and Bacillus macerans. Appl. Environ. Microbiol.
58, 2571–2578.
[67] Kagiyama, N., 1993. A novel fluorescent method for in situ hybridization. Acta Histochem. Cytochem. 26, 441–445.
[68] Kalmbach, S., 1999. Aquabacterium gen. nov., with description of
Aquabacterium citratiphilum sp. nov., Aquabacterium parvum sp. nov. and
Aquabacterium commune sp. nov., three in situ dominant bacterial species from the Berlin drinking water system. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 769–777.
[69] Kampfer, P., 1996. Characterization of bacterial communities from activated sludge-culture-dependent numerical identificadeboertion versus in situ identification using group- and genusspecific rRNA-targeted oligonucleotide probes. Microb. Ecol. 32, 101–121.
[70] Karttunen, T.J., 1996. Detection of Helicobacter pylori in paraffin-embedded
gastric biopsy specimens by in situ hybridization. Am. J. Clin. Pathol. 106, 305–311.
[71] Kemp, P.F., 1993. Estimating the growth rate of slowly growing marine bacteria from RNA content. Appl. Environ. Microbiol. 59, 2594–2601.
[72] Kempf, V.A., 2000. Fluorescent in situ hybridization allows rapid identification of microorganisms in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 38, 830– 838.
[73] Kenzaka, T., 1998. rRNA targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterialcommunity structure in river water. Microbiology 144, 2085–2093.
[74]Kogure, K., 1979. A tentative direct microscopic method for counting living
TÀI LIỆU THAM KHẢO
http://www.ebook.edu.vn 47
[75] Krimmer, V., 1999. Detection of Staphylococcus aureus and Staphylococcus
epidermidis in clinical samples by 16S rRNA-directed in situ hybridization. J. Clin. Microbiol. 37, 2667–2673.
[76] Landegent, J.E., 1984. 2-Acetylaminofluorene-modified probes for the indirect hybridocytochemical detection of specific nucleic acid sequences. Exp. Cell. Res. 153, 61–72.
[77] Langendijk, P.S., 1995. Quantitative in situ hybridization of Bifidobacterium
spp. With genus-specific 16S rRNA-targeted probes and its application in faecal samples. Appl. Environ. Microbiol. 61, 3069–3075.
[78] Lathe, R., 1985. Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data. Theoretical and practical considerations. J. Mol. Biol. 183, 11– 12.
[79] Lawrence, J.R., 1998. The study of biofilms using confocal laser scanning microscopy. In: Wilkinson, M.H.F., Schut, F. (Eds.), Digital Image Analysis of Microbes — Imaging, Morphometry, Fluorometry and Motility Techniques and Applications. John Wiley, Chichester, UK, pp. 431–465.
[80] Lee, N., 1999. Combination of fluorescent in situ hybridization and microautoradiography, a new tool for structure–function analyses in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1289–1297.
[81] Lee, S., 1993. Use of multiple 16S rRNA-targeted fluorescent probes to increase signal strength and measure cellular RNA from natural planctonic bacteria. Mar. Ecol. Prog. Ser. 101, 193–201.
[82] Lemke, M.J., 1997. Comparison of methods for the concentration of bacterioplancton for in situ hybridization. J. Microbiol. Methods 29, 23–29. [83] Li, S., 1997a. Quantitative fluorescence in situ hybridization of
Aureobasidium pullulans on microscopic slides and leaf surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 63, 3261–3267.
[84] Li, X., 1997b. Improved microscopic identification of Clavibacter