a. Khoang miệng
Phân tích các quần thể bằng FISH đã thể hiện sựđặc biệt hữu ích trong việc mô tả các hỗn hợp vi khuẩn phổ biến hay các hệ vi sinh vật nhiễm tạp. Những phân tích này đã cho thấy trong khoang miệng người có chứa hơn 300 loài vi khuẩn khác nhau, trong đó có nhiều loài rất phức tạp khi tiến hành nuôi cấy hoặc chưa từng
được nuôi cấy. Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên quan
đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này. Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt sẽ chỉ có được sự xem thường đối với đa dạng vi sinh vật. Những lợi ích khi sử
dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện trên những vi khuẩn kị khí gram âm, như
Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythus và Prevotella intermedia trong thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng [48,49]. Phân tích sâu hơn trên môi trường phân tử cho thấy một sự đa dạng không ngờ của các loại xoắn khuẩn trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 25
của viêm răng [24]. Số lượng lớn các vi khuẩn hình xoắn và sự đa dạng hình thái của chúng
(a) (b)
Hình 6. Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng. (a) lai với các
đầu dò vi khuẩn là EUB338 gắn nhãn FITC (xanh lá cây) để hiển thị hình thái khác nhau của vi khuẩn ở cấp độđơn bào và TRE I gắn nhãn Cy3 (vàng) để dò tìm các loài phát sinh thuộc xoắn khuẩn nhóm I, hầu hết chưa được nuôi cấy. (b) trên cùng một đối tượng, tiến hành lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh lá cây) và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng) dò tìm xoắn khuẩn trong khoang miệng thuộc các loài phát sinh nhóm II [100]. Cần lưu ý rằng sự phân loại xoắn khuẩn theo các nhóm phát sinh loài dựa trên những dữ liệu của rRNA 16S [24].
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 26
(a)
(b)
Hình 7. FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I. (a) độ
phân giải thấp với chất mang FluoX Cy3. (b) độ phóng đại cao hơn, các xoắn khuẩn nhóm I (màu vàng), bao quanh là các vi khuẩn khác (màu xanh lá cây), các tế bào máu
(đen) được nhóm lại xung quanh một lõi dày đặc các vi khuẩn ở trung tâm.
đã được phát hiện thông qua FISH trên các vết bẩn của mảng bám răng (hình 7) [100]. Hơn nữa, cấu tạo và phân bố không gian của các xoắn khuẩn trong khoang
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 27
miệng có thểđược nghiên cứu trong màng sinh học (Hình 8). Tuy nhiên, vì dữ liệu dịch tễ học về tổ chức của xoắn khuẩn với các bệnh răng miệng độc lập với nhau nên không thể chứng minh được khả năng gây bệnh của chúng, cùng một loại đầu dò oligonucleotide được sử dụng trên các đoạn mô của sinh thiết lấy từ gót chân của các loài thú nuôi bị bệnh viêm da. Các bệnh mãn tính, mô hoại tử hay các bệnh khó xử lý sẽ được kết hợp xử lý với một hỗn hợp vi khuẩn kị khí được tìm thấy ở
bệnh viêm răng. Sự phân lớp các nhóm vi khuẩn khác nhau có thể được tìm thấy chỉ trong một mô, cho thấy rằng các loài phát sinh đã biết của xoắn khuẩn có nhiều khả năng xâm lấn mô và duy trì bệnh hơn các xoắn khuẩn khác, que hoặc cầu khuẩn [101].
b. Dạ dày – ruột
Vì ruột là phần vi sinh vật phát triển nhiều nhất trong cơ thể con người, sự khỏe mạnh của hệ ruột và sự hình thành các hệ sinh vật bám dính trên thành ruột người là điều cần quan tâm nhất. Một lần nữa, các kỹ thuật nuôi cấy thông thường lại không đánh giá chính xác được số lượng vi khuẩn [57]. Hiện nay, phương pháp FISH khi nghiên cứu các hệ vi sinh vật đường ruột ở người thường chỉ nghiên cứu hạn chếở nguồn phân mà thôi. Số lượng Bifidobacterium và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm Ramulus flavonoid trong các mẫu phân được ước tính bằng cách sử
dụng các đầu dò đặc hiệu tương ứng với các chủng, loài vi sinh vật [77,1299]. Sự
biến thiên số lượng vi khuẩn, bao gồm các chủng Bacteroides và Clostridium ssp., Streptococcus, Lactococcus và nhóm Clostridium coccoides-Eubacterium rectale
trong phân người được theo dõi trong khoảng thời gian 8 tháng [41]. Kỹ thuật này
đã được cải tiến tốt hơn bằng cách phát triển khả năng thu nhận hình ảnh tự động và các phần mềm phân tích cho phép đếm bằng kính hiển vi các nhóm vi khuẩn
đường ruột một cách nhanh và chính xác [60]. Gần đây, sự khác biệt về phát triển của vi khuẩn đường ruột của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và sữa bột đã được nghiên cứu [58]. Tuy nhiên, sự phân bố không gian sinh lý của hệ vi khuẩn đường ruột người và màng sinh học đường ruột vẫn chưa được hiểu rõ hết.
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 28
Hiện nay, một số phương pháp đã được áp dụng thành công trên động vật để
nghiên cứu sự phân bố không gian của vi khuẩn đường ruột và để phát hiện toàn bộ
mầm bệnh trong môi trường phức tạp này. E.coli đã được phát hiện trong phần
đông lạnh của ruột lớn chuột bằng cách sử dụng các đầu dò ứng với các vùng đặc hiệu của 23S rRNA. Trong nghiên cứu này, các tế bào E.coli được quan sát trong chất nhờn nằm trên các tế bào biểu bì mà không hề có sự gắn kết trực tiếp nào đến các tế bào này [112]. Các xoắn khuẩn của loài Brachyspira/Serpulinađã được hiển thị chính xác trong ruột lợn mắc bệnh lỵ (Boye et al., 1998). Brachyspira pilosicoly
xâm nhập và định cư trên các bề mặt tế bào biểu bì và các tiểu nang của lợn đã
được tiêm phòng [62]. Một nghiên cứu tương tự cũng đã được thực hiện để kiểm tra sựảnh hưởng của những vi khuẩn hình que gây bệnh viêm phổi trong quá trình xâm lấn vào ruột già của chuột. Trong một nghiên cứu khác khi thí nghiệm trên chuột bị nhiễm bệnh, Nordentoft và cộng sự (1997) đã cố gắng thiết lập một chẩn
đoán bằng phương pháp FISH để phát hiện ra chủng Salmonella. Do sự tương đồng về trình tự, nên 16S rRNA hầu như không phân biệt được các chủng thuộc loài
Enterobacteriaceae. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã sử dụng một trình tự lấy từ
rRNA 23S sử dụng như một trình tựđích cho các đầu dò đặc hiệu phát hiện ra 49 trong 55 chủng gây bệnh thuộc Salmonella nhưng không có loài nào trong 43 loài khác được nghiên cứu thuộc chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae. Salmonella cũng
được phát hiện trong các đoạn mẫu parrafin của ruột kết và mô phổi bị nhiễm bệnh của chuột cũng như từđộng vật đã từng bị nhiễm salmonella.
c. Nhiễm khuẩn đường hô hấp
Haemophiolus influenzae là nguyên nhân chung cho bệnh viêm đường hô hấp cấp và mãn tính. Khi sử dụng FISH, các dòng vi khuẩn H.influenzae đã được tìm thấy trong các mô hạch nhân ở họng của trẻ em trong giai đoạn xuất hiện triệu chứng. Vi khuẩn còn được phát hiện trong các đại thực bào, như các lớp tế bào dưới biểu mô. Các nhà khoa học đã cùng nghiên cứu và phát hiện ra các tế bào nhiễm bệnh này khi sử dụng FISH để dò tìm Haemophilus và sử dụng chất miễn
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH
http://www.ebook.edu.vn 29
dịch huỳnh quang để dò tìm các tế bào CD 14. Kết quả cho thấy rằng Haemophilus
có thể tồn tại được trong các đơn bào hoặc các đại thực bào.
Gần đây, một tập hợp các đầu dò oligonucleotide được thiết kế để dò tìm đặc hiệu đối với các mầm bệnh phân lập từ tế bào xơ gan của bệnh nhân, bao gồm
Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus và Candida albicans. Trong một thử nghiệm lâm sàng với các mẫu đờm và mẫu gạc họng, các đầu dò đã phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn gây cấp tính ở bệnh nhân xơ nang [59]. So với các kỹ thuật nuôi cấy thông thường, sự chính xác của FISH là 100%.