FISH là một phương pháp dò tìm nhanh chóng, rẻ tiền và dễ dàng thực hiện. Nó
đặc biệt hữu ích khi dò tìm các vi khuẩn phát triển chậm, khó nuôi cấy hay không thể nuôi cấy. Nếu được áp dụng trên các mẫu máu hoặc dịch não tủy, nó có thể
chẩn đoán nhanh và chính xác mức độ nhiễm trùng của các bệnh nhân bệnh nặng. Một bước quan trọng trong việc nhận dạng lâm sàng vi sinh vật sẽđược thực hiện nếu FISH có thể được tiến hành tựđộng. Hệ thống phân tích hình ảnh tự động đã
được thử nghiệm. Tuy nhiên, việc tựđộng hóa trong xử lý mẫu cũng như kiểm soát hợp lý các kết quả bằng cách sử dụng các hệ thống chuyên môn luôn được yêu cầu. Một hệ thống các công cụ lai tạo đã được tạo ra, nhưng chúng đã không được sử
dụng trên bất cứ mẫu vi sinh vật nào cả [23]. Bên cạnh sự giảm bớt những thao tác bằng tay, tựđộng hóa FISH còn tạo ra được doanh thu rất cao và cải thiện khả năng tái chế các mẫu vi sinh vật lâm sàng trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng trong tương lai gần, FISH vẫn chưa thay thế được các phương pháp nuôi cấy thông thường.
Một cải tiến nữa của kỹ thuật này là kết hợp định vị vi khuẩn với bổ sung những thông tin về tính chất cơ bản của chúng, như biểu hiện gen, quá trình trao
đổi chất hay biểu hiện kháng nguyên.
Kỹ thuật phóng xạ tự ghi có thểđược sử dụng để mô tả hoạt động trao đổi chất của tế bào. Các hỗn hợp tế bào hay bùn hoạt hóa xác định được ủ với các chất nền hữu cơ và vô cơ được gắn phóng xạ như glucose, acetate hay bicarbinate. Sau khi mẫu được cố định và chuẩn bị các bản kính, chất phóng xạ có thể được quan sát thông qua sự gắn kết và phát triển của hệ nhũ tương sơ đồ phóng xạ tự ghi. Khi sử
dụng kỹ thuật này song song với FISH, các chất nền phóng xạ đã biểu hiện sự hạn chế trong một số loài vi khuẩn và có thể được theo dõi trong mẫu bùn hoạt tính trong điều kiện hiếu khí so với kị khí của FISH [80] và trong các quần thể sinh vật phù du trong tự nhiên [106].
CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN
http://www.ebook.edu.vn 34
Một cách tiếp cận khác để phân tích các mẫu trong y khoa là việc sử dụng kết hợp FISH và đánh dấu miễn dịch. Trong khi FISH cho phép xác định các vi khuẩn riêng lẻ, thì miễn dịch huỳnh quang (IF) có thể cung cấp thêm thông tin về biểu hiện của kháng nguyên. Sự kết hợp của hai kỹ thuật đã tối ưu và ước lượng chính xác cho việc nhận dạng các vi khuẩn trong hỗn hợp bằng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy [151]. Kể từ khi các kháng thể thường xuyên được đặc hiệu ở cấp loài và thấp hơn, sự kết hợp này cho phép xác định nhanh chóng và tự động trên một khoảng rộng của các cấp độ phát sinh loài. FISH và IF cũng được sử dụng đồng thời để nhận biết Bacteroides fragilis trộn lẫn với E.coli bằng kính hiển vi [114]. Các đầu dò vi khuẩn hay đầu dò đặc hiệu cho các loài cụ thểđã được sử dụng cho FISH, sau đó tiếp tục xử lý bằng kháng thểđơn dòng hay huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc hiệu cho một kháng nguyên chung của B.fragilis. Bởi vì cường độ tín hiệu phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, vào giai đoạn tiền xử lý và các bước rửa trong suốt quá trình, nên các nhà khoa học đã cho rằng sự kết hợp của hai kỹ thuật mang ý nghĩa nghiên cứu hơn là một công cụ chẩn đoán. Tuy nhiên, nhận dạng tại chỗ vi sinh vật kết hợp với phân tích các biến thể kháng nguyên nhưng không có nuôi cấy có thể giúp hiểu rõ cơ chế gây bệnh của vi khuẩn.
Một kỹ thuật để phân tích các độc tốđã được phát triển bởi Warner và các cộng sự (1998). Thông thường, khi tiến hành FISH với một đầu dò định hướng vào rRNA 16S để xác định các vi khuẩn Listeria monocytogenes được kết hợp với phát hiện tại chỗ mRNA của các gen xâm nhập protein, mã hóa cho một độc tố trong cùng một loài. Do sự không ổn định và số lượng bản sao của mRNA thấp hơn rRNA, nên một kỹ thuật FISH với độ nhạy cao đã được phát triển. Các đầu dò
polyribonuclotide đối nghĩa, bên trong có gắn nhãn digoxygenin trong phiên mã
ngược, đã được lai với toàn bộ tế bào và phát hiện bởi kháng thể có gắn nhãn HRP chống DIG và hệ thống TSA phát huỳnh quang như mô tảở trên. Kỹ thuật này khá phức tạp và phải được tối ưu hóa cho từng loài mới. Tuy nhiên, đây là một công cụ đầy hứa hẹn cho nghiên cứu biểu hiện gen tại chỗ trong những môi trường phức tạp. Gần đây, một phân tử chỉ thị huỳnh quang, protein huỳnh quang xanh lá
CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN
http://www.ebook.edu.vn 35
cây(GFP) đã được tìm thấy ngày càng nhiều. Bằng cách đưa các gen tương ứng vào plasmid hay DNA nhiễm sắc thể của một sinh vật quan tâm, các biểu hiện của GFP có thểđược sử dụng để mô tả và quan sát hoạt động của promoter hoặc biểu hiện gen ở cấp độ tế bào. Thí nghiệm phân tích gen này đã được kết hợp với FISH
để tiến hành phân tích các mẫu bùn hoạt tính [33]. Trong mẫu màng sinh học xác
định, sự phân bố không gian của vi sinh vật, thời gian cảm ứng của các promoter, biểu hiện của promoter và sự tương tác của vi khuẩn có thể được phân tích [98]. Cách tiến hành tương tự đã được lựa chọn để xác định các tế bào Pseudomonas putida bởi FISH và để hình dung đồng thời sự chuyển plasmid có gắn GFP theo chiều ngang trong một màng sinh học thí nghiệm [25]. Cách tiếp cận này sẽ có tác
động quan trọng về những phân tích cấu trúc của các cộng đồng vi khuẩn phức tạp.
FISH và những đầu dò acid nucleic peptide (PNA) : Gần đây, các đầu dò acid nucleic peptide đã được đưa vào trong các kỹ thuật lai tạo. Các PNA có cấu tạo tương tự DNA nhưng thay cho đường phosphat là bộ khung polyamide không tích
điện. Chúng rất bền nên khó bị biến tính, lai với các trình tự bổ sung với ái lực lớn và có những đặc điểm lai khác nhau. Đến nay, các nhà khoa học đã sử dụng trên một phạm vi lớn các kỹ thuật như PCR kẹp, Sorthern blot để phát hiện các đột biến và tinh sạch DNA. Thông thường, các đầu dò PNA ngắn hơn các oligonucleotide tiêu chuẩn được sử dụng cho các liên kết đặc hiệu. Từđó, chúng dường như là một thay thế thú vị để tiêu chuẩn các đầu dò oligonucleotide. Điều này đã được chứng minh bởi Prescott và Flicker (1999) khi sử dụng các đầu dò PNA đánh dấu biotin kết hợp với hệ thống TSA để dò tìm đặc hiệu và nhạy bén vi khuẩn E.coli trong các mẫu nước. Cách thực hiện này cũng rất nhạy khi dò tìm rRNA trong các tế bào vi khuẩn đã chết một thời gian.
Một trong những nhược điểm chính của FISH khi sử dụng đầu dò
oligonucleotide là các đầu dò bị biến đổi và không xâm nhập đủ vào trong tế bào vi khuẩn do phụ thuộc vào cấu trúc thành tế bào. Điều này rất dễ tìm thấy ở các loài gram dương và các vi khuẩn hình que. Các PNA có thể khắc phục được nhược
CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN
http://www.ebook.edu.vn 36
qua thành tế bào kỵ nước và có thể phát hiện ngay các trực khuẩn gram dương mà không có bước xử lý sơ bộ nào. Sử dụng đầu dò đặc hiệu, các PNA được đánh dấu huỳnh quang, đã phân biệt được các vi khuẩn lao với các loại vi khuẩn khác trên các mẫu nuôi cấy trực khuẩn. Kỹ thuật này đã tạo ra những cải thiện trong chẩn
đoán sơ bộ vi khuẩn lao và có thể giúp FISH trở thành một phương pháp hiệu quả, nhanh và có giá trị trong phân tích lâm sàng vi sinh vật.