3.2.1.1. Lựa chọn nguyên liệu và công thức
Nghiên cứu được thực hiện là sự tiếp nối các kết quả đã đạt được về chế tạo liposom doxorubicin trước đó với mong muốn khắc phục nhược điểm chính của liposom truyền thống là nhanh chóng bị thải trừ khỏi vòng tuần hoàn, tạo một bước tiến gần hơn để ứng dụng liposom vào sử dụng trong thực tiễn. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã cố gắng vận dụng các cải tiến kỹ thuật, cũng như lựa chọn quy trình tiến hành để có thể tạo ra liposom doxorubicin có khả năng tuần hoàn kéo dài tốt nhất dựa trên điều kiện hiện có. Đầu tiên, đó là sử dụng nguyên liệu là phospholipid lòng đỏ trứng đã hydro hóa thay cho phospholipid lòng đỏ trứng chưa được hydro hóa. Sự bão hòa các dây nối đôi sẽ làm tăng nhiệt độ chuyển pha của phospholipid, tăng tính bền vững, giảm tính thấm của lớp màng kép. Cộng thêm việc sử dụng cholesterol cũng đóng góp một phần quan trọng tăng tính ổn định của màng và tăng thời gian tuần hoàn in vivo của liposom [20]. Liposom gắn PEG được tạo thành từ dẫn chất PEG-lipid là DSPE-PEG2000-NH2 đã được chứng minh là có
khả năng tăng thời gian tuần hoàn [57]. Tỷ lệ của DSPE-PEG-NH2 chúng tôi lựa chọn là 5% về số mol so với tổng lipid. Tỷ lệ này cũng là tỷ lệ thích hợp để đạt được thời gian tuần hoàn kéo dài [11],[57].
3.2.1.2. Quy trình chế tạo liposom doxorubicin gắn PEG và các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm tạo thành
Sử dụng phương pháp truyền thống để tạo liposom gắn PEG
Phương pháp gắn PEG trong quá trình tạo liposom (phương pháp truyền thống) là phương pháp được sử dụng phổ biến trên thế giới để tạo liposom gắn PEG. Do dẫn chất PEG-lipid được trộn cùng với các nguyên liệu tạo liposom trước khi hydrat hóa tạo thành màng kép, nên phần PEG sẽ phân bố ở cả 2 bên màng lipid kép của liposom (hình 1.5). Như vậy, so với phương pháp gắn PEG sau khi tạo liposom, phương pháp này cần sử dụng một lượng lớn hơn dẫn chất DSPE-PEG để đạt được mật độ PEG tương đương bên ngoài liposom. Tuy nhiên, phương pháp này lại có những ưu điểm: ít bước thực hiện hơn, không cần loại micell sau khi quá trình gắn kết thúc (so với kỹ thuật post-insertion), liposom tạo thành không bị ảnh hưởng bởi các tác nhân phản ứng (so với kỹ thuật tạo liên kết cộng hóa trị). Có lẽ chính vì vậy mà phương pháp gắn trong quá trình tạo liposom vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu để tạo liposom gắn PEG. Đó cũng là lý do chúng tôi lựa chọn phương pháp này để tạo liposom gắn PEG.
Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước của liposom tạo thành
Cải tiến hơn các nghiên cứu trước [1],[2], trong nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp đẩy qua màng để làm giảm và đồng nhất hóa kích thước tiểu phân. Phương pháp này cho kích thước tiểu phân nhỏ và đồng nhất hơn so với phương pháp siêu âm mà tác giả Nguyễn Thị Huê [1], Nguyễn Văn Lâm [2] đã sử dụng.
Kích thước tiểu phân là một yếu tố quan trọng, không chỉ ảnh hưởng tới thời gian tuần hoàn của liposom trong máu mà còn ảnh hưởng tới khả năng tích lũy của liposom tại khối u. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra liposom gắn PEG có kích thước 100 – 200 nm có thời gian tuần hoàn kéo dài nhất, trong khi các liposom có kích thước > 200 nm hoặc < 70 nm nhanh bị thải trừ khỏi vòng tuần hoàn hơn [39]. Ngoài ra, mặc dù các liposom có kích thước khoảng 400 nm vẫn có khả năng thoát mạch để vào khối u, nhưng để đạt được hiệu
quả tốt nhất, kích thước liposom nên dưới 200 nm [43],[45]. Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn màng đẩy cuối cùng với kích thước lỗ lọc là 80 nm nhằm tạo ra các liposom có kích thước khoảng 100 nm [20]. Liposom doxorubicin gắn PEG tạo thành có kích thước trung bình 124,9 nm là tương đối phù hợp để đạt được hiệu quả tuần hoàn kéo dài và có thể đưa thuốc tới đích nhờ hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ.
Thế zeta của liposom tạo thành
Thế zeta của các liposom không gắn PEG là tương đối tốt (|Z| > 30 mV) (-32,6 mV và -40,1 mV tương ứng với trước và sau khi tải thuốc) và tốt hơn so với các nghiên cứu trước (-26mV [1], -25,8 mV và -25,6 mV [5]). Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy liposom gắn PEG tạo thành có thế zeta nhỏ hơn nhiều so với liposom không gắn PEG. Nguyên nhân có thể do sự có mặt của chuỗi PEG trên bề mặt liposom đã làm giảm sự di chuyển của liposom trong điện trường và do đó làm giảm thế zeta [33],[54]. Ngoài ra, theo Kostarelos và cộng sự (1999), khi gắn các polyme lên bề mặt liposom làm cho mặt phẳng trượt di chuyển ra xa bề mặt liposom và do đó làm giảm giá trị tuyệt đối của thế zeta [34].
Mặc dù sự gắn PEG làm giảm giá trị tuyệt đối của thế zeta nhưng nó không làm giảm điện tích bề mặt của liposom [54]. Do đó, thế zeta trong trường hợp của liposom gắn PEG không giúp ta dự đoán được về sự ổn định của hệ.
Hiệu suất liposom hóa doxorubicin
Căn cứ vào kết quả đạt được của tác giả Nguyễn Thị Huê [1], chúng tôi lựa chọn kỹ thuật kỹ thuật chênh lệch amoni sulfat để tải doxorubicin vào liposom gắn PEG. Đây cũng là kỹ thuật được sử dụng trong quy trình chế tạo của Doxil® [16]. Hiệu suất liposom hóa doxorubicin đạt được (bảng 3.4) tương đối cao (>80%). Liposom gắn PEG cho hiệu suất hơi thấp hơn một chút (82,54% so với 89,60 % của liposom không gắn PEG). Điều này có thể lý giải là do chúng tôi chưa tối ưu hóa được tỷ lệ tải thuốc, cũng như là điều kiện tiến hành loại thuốc tự do. Khi tiến hành thẩm tách để loại thuốc tự do trong khoảng thời gian dài (24 giờ) ở nhiệt độ phòng thì bên cạnh việc thuốc tự do bị loại đi thì thuốc trong liposom cũng có thể bị rò rỉ, dẫn đến làm giảm hiệu suất. Để khắc phục điều này có thể sử dụng thiết bị lọc tiếp tuyến như của tác giả Nguyễn Văn Lâm [2] hoặc sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel [22] để làm giảm thời gian tiếp xúc với nhiệt độ cao của liposom.