2.3.2.1. Phương pháp đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân
Nguyên tắc: Kích thước tiểu phân được đánh giá bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng năng động (DLS). Khi chiếu chùm tia sáng vào hỗn dịch liposom có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ khác nhau của chùm sáng ra. Dựa vào mức độ tán xạ của chùm sáng ra, ta có thể tính được kích thước của liposom [27].
Tiến hành: Sử dụng thiết bị đo kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90. Dịch liposom được pha loãng 200 lần bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc 0,2 µm và cho vào cuvet sao cho chiều cao phần dịch khoảng 1 cm. Cho cuvet vào buồng đo và tiến hành chạy máy, kết quả thu được hiển thị trên màn hình.
2.3.2.2. Phương pháp xác định thế zeta:
Nguyên tắc: Thế zeta được xác định gián tiếp dựa trên hiện tượng điện di, tức dựa trên sự di chuyển tương đối của hạt mang điện so với chất lỏng mà nó được phân tán dưới tác dụng của điện trường [26].
Tiến hành: Pha loãng mẫu liposom 200 lần bằng nước cất 2 lần lọc qua màng lọc 0,2 µm. Bơm từ từ vào cuvet sao cho không có bọt khí. Cho cuvet vào buồng đo của thiết bị
zetasizer ZS90 và tiến hành đo. Kết quả hiển thị trên màn hình.
2.3.2.3. Phương pháp định lượng doxorubicin
Nguyên tắc: Phá vỡ màng liposom bằng chất diện hoạt Triton X-100, tiến hành định lượng doxorubicin bằng phương pháp đo quang. Nồng độ của doxorubicin được tính dựa vào đường chuẩn xây dựng trước đó.
Tiến hành:
* Xây dựng đường chuẩn doxorubicin
Dãy dung dịch chuẩn được pha như sau: Cân chính xác 25mg doxorubicin hydroclorid, hòa tan trong dung dịch NaCl 0,9% và cho vào bình định mức 25 ml. Thêm nước đến vạch để được nồng độ 1 mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng bằng NaCl 0,9% để được các dung dịch có nồng độ doxorubicin hydroclorid lần lượt là 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 và 0,4 mg/ml. Hút chính xác 1 ml các dung dịch trên và thêm vào 9 ml dung dịch Triton X-100 1% pha trong nước cất 2 lần (tt/tt). Lắc kỹ và đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 480 nm với mẫu trắng được pha từ 1 ml NaCl 0,9% và 9 ml Triton X-100 1%. Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị thể hiện tương quan giữa nồng độ dược chất (CS) và độ hấp thụ (DS), xác định phương trình hồi quy và hệ số tương quan R.
* Định lượng doxorubicin trong hệ liposom
Mẫu thử: lấy chính xác 125 µl dịch liposom, pha loãng bằng NaCl 0.9% thành 1 ml. Thêm vào 9 ml Triton X-100 1%. Lắc mạnh. Đun cách thủy hỗn hợp ở 60oC trong 4 phút, thỉnh thoảng lắc để giải phóng thuốc hoàn toàn. Để hỗn hợp về nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo quang ở bước sóng 480 nm. Mẫu thử được làm 3 lần và lấy kết quả trung bình.
Mẫu trắng: lấy chính xác 1 ml NaCl 0,9%, thêm vào 9 ml Triton X100 1%. Lắc mạnh.
2.3.2.4. Xác định hiệu suất liposom hóa doxorubicin
Tiến hành: Định lượng doxorubicin trong hệ liposom trước (Ct) và sau (Cs) khi thẩm tách loại doxorubicin tự do (không được liposom hóa) theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.2.3. Hiệu suất liposom hóa doxorubicin được xác định theo công thức (1):
Trong đó: Ct và Cs lần lượt là nồng độ doxorubicin trước và sau khi thẩm tách loại doxorubicin tự do.