gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin
2.3.3.1. Chuẩn bị các điều kiện tiến hành thí nghiệm
* Động vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng được đưa về phòng thí nghiệm (bộ môn Dược lực) nuôi 5 ngày cho ổn định. Trước khi tiêm thuốc 1 ngày, cho chuột nhịn đói qua đêm để xác định cân nặng của chuột. Chọn những cá thể có khối lượng từ 22 – 28g, chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm: nhóm T (nhóm trắng, tiêm nước muối sinh lý), nhóm F (tiêm doxorubicin dạng tự do), nhóm C (tiêm liposom doxorubicin), nhóm S (tiêm PEG-liposom doxorubicin).
* Thuốc tiêm:
- Thuốc tiêm doxorubicin dạng tự do: hòa tan doxorubicin hydroclorid trong NaCl 0,9% vô khuẩn để được nồng độ khoảng 2 mg/ml. Lọc qua màng PTFE 0,2µm, bỏ một phần dịch lọc đầu. Phần dịch sau được đựng vào lọ đã hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp ở 100oC trong 60 phút. Trộn đều và hút một phần dịch ra bằng bơm tiêm vô khuẩn để tiến hành định lượng nồng độ doxorubicin theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.2.3.
- Thuốc tiêm liposom doxorubicin và PEG-liposom doxorubicin: lọc qua màng PTFE 0,2 µm, bỏ một phần dịch lọc đầu. Lắc đều dịch thu được và một phần cũng được lấy ra để định lượng nồng độ doxorubicin.
- Cuối cùng, pha loãng các dạng thuốc tiêm trên bằng dung dịch NaCl 0,9% vô khuẩn để đạt nồng độ 1 mg/ml.
2.3.3.2. Tiêm chuột và lấy máu
4 nhóm chuột lại được chia ra thành các nhóm nhỏ (3 con/nhóm nhỏ), tương ứng với các thời điểm sẽ lấy máu sau khi tiêm: 5 phút, 4 giờ và 24 giờ. Chuột được tiêm tĩnh mạch đuôi nước muối sinh lý (nhóm T) hoặc doxorubicin (các dạng tương ứng) với liều 10 mg/kg trong thể tích tiêm 10 ml/kg. Sau các thời điểm 5 phút, 4 giờ, 24 giờ, máu chuột
được lấy từ hốc mắt vào ống heparin hóa. Ống heparin hóa được đậy nắp lại và lăn nhẹ giữa hai lòng bàn tay và đưa lên đưa xuống nhẹ nhàng để máu trộn đều với heparin trong ống.
2.3.3.3. Phương pháp chiết doxorubicin toàn phần trong huyết tương
Nguyên tắc: Sử dụng isopropanol acid hóa (0,075N HCl trong isopropanol 90% (tt/tt)) để chiết doxorubicin toàn phần từ huyết tương [25],[28].
Hình 2.1. Quy trình chiết doxorubicin toàn phần từ huyết tương
2.3.3.4. Phương pháp định lượng doxorubicin trong huyết tương
Nguyên tắc:Định lượng doxorubicin bằng phương pháp đo quang phổ huỳnh quang. Nồng độ doxorubicin được xác định từ mật độ huỳnh quang của dịch chiết doxorubicin và đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch doxorubicin đã biết trước nồng độ. Do trong huyết tương tồn tại cả các dẫn chất chuyển hóa của doxorubicin mà phương pháp đo quang phổ huỳnh quang không phân biệt được nên nồng độ xác định được là nồng độ tương đương doxorubicin (doxorubicin equivalents) [28].
Tiến hành:
* Xây dựng đường chuẩn doxorubicin:
- Pha các dung dịch chuẩn: Cân chính xác 25 mg doxorubicin, hòa tan bằng NaCl 0,9% rồi cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung NaCl 0,9% đến vạch để được dung dịch doxorubicin hydroclorid nồng độ 1 mg/ml. Hút chính xác 0,5 ml cho vào bình định mức 10 ml, thêm NaCl 0,9% đến vạch để được dung dịch 50 µg/ml. Sau đó pha loãng bằng NaCl 0,9% để được các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,25; 0,5; 1,0; 5; 10 µg/ ml. Hút 100 µl các dung dịch chuẩn, thêm vào 2,4 ml isopropanol acid hóa, lắc đều. Tiến hành đo mật độ huỳnh quang ở bước sóng kích thích 471 nm, bước sóng phát xạ 554 nm.
- Mẫu trắng: hút 100 µl dung dịch NaCl 0,9%, thêm vào 2,4 ml isopropanol acid hóa, lắc đều.
* Đo huỳnh quang các mẫu chiết doxorubicin từ huyết tương:
Các ống nghiệm bảo quản ở - 20oC được lấy ra và để về nhiệt độ phòng. Lắc đều ống nghiệm 1-2 phút. Tiến hành đo mật độ huỳnh quang các mẫu chiết nhóm F,C,S ở bước sóng kích thích 471 nm, bước sóng phát xạ 554 nm với mẫu trắng là dịch chiết từ nhóm T. Trong trường hợp giá trị huỳnh quang nằm ngoài đường chuẩn, mẫu chiết được pha loãng
với isopropanol acid hóa và mẫu trắng cũng được pha loãng với tỷ lệ tương tự.
2.3.3.5. Tính giá trị AUC0-24h của các dạng thuốc của doxorubicin
Giá trị diện tích dưới đường cong 0 đến 24 giờ (AUC0-24h) của các dạng thuốc: doxorubicin tự do, liposom doxorubicin và PEG-liposom doxorubicin được tính từ nồng độ tương đương doxorubicin trung bình trong huyết tương theo quy tắc hình thang. Công thức tính cụ thể như sau:
AUC0-24h = 0,5 x [(C0,083 + C4) x (4 – 0,083) + (C4 + C24) x 20] (2) Trong đó:
AUC0-24h là giá trị diện tích dưới đường cong từ 0 – 24 giờ.
C0,083, C4, C24 là nồng độ tương đương doxorubicin trung bình tại thời điểm 5 phút, 4 giờ và 24 giờ.