PEG về một số chỉ tiêu:
+ Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân + Thế zeta
+ Hiệu suất tải thuốc
- Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn của liposom doxorubicin trong máu thông qua việc khảo sát nồng độ doxorubicin tại một số thời điểm sau khi tiêm các dạng thuốc khác nhau của doxorubicin: dạng thuốc tự do, dạng liposom không gắn PEG và liposom gắn PEG.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo liposom doxorubicin gắn PEG và liposom doxorubicin không gắn PEG gắn PEG
Bảng 2.1. Nguyên liệu tạo liposom gắn và liposom không gắn PEG
STT Tên nguyên liệu Liposom gắn PEG Liposom không gắn PEG
2. Cholesterol 62,82 mg 62,82 mg
3. DSPE-PEG2000-NH2 74,26 mg 0
Hai mẫu liposom doxorubicin không gắn PEG (liposom doxorubicin) và liposom doxorubicin gắn PEG (PEG-liposom doxorubicin) với các thành phần nguyên liệu ban đầu như trong bảng 2.1 được chế tạo với cùng một quy trình. Quy trình chế tạo được xây dựng dựa trên sự tham khảo các nghiên cứu trước đó [1],[2],[15] và có một vài thay đổi để phù hợp với điều kiện thực tế, cụ thể gồm các bước như sau:
Bước 1: Hydrat hóa màng lipid trong dung dịch amoni sulfat tạo liposom nhiều lớp
Tạo lớp lipid mỏng: Hòa tan phospholipid trứng đã hydro hóa, cholesterol và DSPE- PEG2000-NH2 (nếu có) vào 15 ml cloroform. Toàn bộ dung dịch được cho vào bình cầu dung tích 1000 ml, tiến hành cất quay chân không ở 50oC, tốc độ quay đặt ở mức 5. Sau khi lớp màng mỏng lipid được tạo thành, tiếp tục cất quay thêm 3 giờ để làm bay hơi hết dung môi hữu cơ.
Hydrat hóa màng mỏng lipid bằng 25 ml dung dịch amoni sulfat nồng độ 250 mM, ở 50oC, tốc độ quay ở mức 5. Quá trình hydrat hóa được thực hiện 2 giờ để đảm bảo lớp màng lipid phân tán hoàn toàn vào dung môi phân cực và tạo thành các liposom nhiều lớp.
Bước 2: Làm nhỏ và đồng nhất hóa kích thước tiểu phân bằng phương pháp đẩy qua
màng.
Liposom nhiều lớp tạo thành ở bước trên được đẩy lần lượt qua màng polycarbonat với kích thước lỗ 0,40 µm 8 lần và 0,08 µm 10 lần. Thiết bị đẩy qua màng Emulsiflex C5 và mẫu liposom được làm nóng ở nhiệt độ 50oC trước khi tiến hành 5 – 10 phút. Áp suất đẩy qua màng khoảng 174 psi. Để mẫu liposom sau khi đẩy qua màng ổn định trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Liposom được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC để tiếp tục các giai đoạn tiếp theo.
Bước 3: Hình thành chênh lệch nồng độ amoni sulfat
Chênh lệch nồng độ amoni sulfat được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp thẩm tách trong môi trường đệm PBS pH 7,4 (NaCl 8,0g; KCl 0,2g; Na2HPO4.12H2O 2,9g; KH2PO4 0,2g pha trong 1 L nước cất) để loại muối amoni sulfat ở môi trường bên
ngoài liposom. Thể tích dung dịch đệm lớn ít nhất gấp 100 lần thể tích dịch thẩm tách. Dung dịch đệm được thay mới sau 2 giờ, 7 giờ và quá trình thẩm tách kết thúc sau 24 giờ. Trong quá trình này, mẫu được tránh ánh sáng bằng cách bọc giấy nhôm.
Bước 4: Liposom hóa doxorubicin
Trước khi tiến hành, hỗn dịch liposom được làm nóng ở nhiệt độ 50oC trong 10 phút. Tiến hành rắc nhẹ một lượng doxorubicin thích hợp vào hỗn dịch liposom để đạt nồng độ 2 mg/ml trong điều kiện khuấy từ. Ủ mẫu trong 60 phút ở nhiệt độ 50oC. Trong quá trình ủ, mẫu được bọc giấy nhôm để tránh ánh sáng. Một phần dịch liposom được giữ lại để xác định nồng độ doxorubicin ban đầu.
Bước 5: Loại doxorubicin không được liposom hóa
Doxorubicin không được liposom hóa được loại bằng phương pháp thẩm tách tương tự như bước 3. Dung dịch đệm PBS pH7,4 được thay vào lúc 3 giờ, 7 giờ và quá trình kết thúc sau 24 giờ.