1.1.Tổng số vi sinh vật hiếu khí (20)

- Cân nhắc trong việc lựa chọn nhà cung cấp nguyên liệu, coi trọng yếu tố chất lượng của nguyên liệu đầu vào

1.1.Tổng số vi sinh vật hiếu khí (20)

- Chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm.

- Biểu diễn bằng đơn vị CFU/g hay CFU/ml

- Xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

–

–

– Hình 6.1: cấy vi sinh vật lên môi trường Ảnh hưởng dến quá trình lên men:  Ảnh hưởng dến quá trình lên men:

- Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu hiển thị mức độ an toàn vệ sinh của thực phẩm; đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật; nguy cơ hư hỏng của thực phẩm; giới hạn về thời gian, hạn sử dụng - bảo quản của sản phẩm; mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm.

- Mọi lý do về tăng số lượng của vi sinh vật trong thực phẩm vượt quá giới hạn cho phép đều là cơ sở để phân biệt thực phẩm có an toàn, có đảm bảo vệ sinh hay có dấu hiệu hư hỏng hay không.

–

 Nếu lượng vsv hiếu khí tồn tại quá mức cho phép, ngoài các vsv cần cho qúa trình lên men thì những vsv còn lại

– + Nếu không gây hại thì việc nó tồn tại sẽ làm tiêu hao bớt chất dinh dưỡng mà môi trường cung cấp, dẫn đến các vsv cần cho qúa trình lên men bị thiếu hụt nguồn thức ăn => hoạt lực lên men kém => Không đạt nồng độ mong muốn

– + Nếu là vi sinh vật gây hại:

– Vừa chiếm thức ăn vừa lấn áp sự phát triển của nấm men, và gây nhiễm độc cho sản phẩm => Quá trình lên men diễn ra chậm, hoạt lực yếu. –

– Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy đường, tạo mangf nhầy, chất keo tụ, tạo H2S, Nh3,.. => Phá vỡ cảm quan của sản phẩm

 Cách khắc phục:

- Kiểm tra kĩ nguồn nguyên liệu đầu vào: Nhà cung ứng, tình trạng vật lý, …. - Kiểm tra tổng vi sinh vật hiếu khí của nguyên liệu trước khi đưa vào sản xuất 1.2.Coliforms và E.coli (21)

- Coliforms là nhóm VK Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, lên men lactose sinh hơi trong 24- 48h ở 35°C

- Nhóm Coliforms bao gồm 4 giống là Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae và Citrobacter

- Vi khuẩn coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên men đường lactose ở 44-45 độ C Coliforms phân là những coliform chịu nhiệt có khả năng sinh Indol trong mat trypton

- Ecoli là coliforms phân cho kết quả thử nghiệm MVC (to)

- Nhóm Coliform sinh hơi khi nuôi trong mt canh thang lactose mật bò BGBL (Brilliant Green Bile Broth Lactose) và LS (Lauryl Sulphate broth)

- Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, MPN (Most Probable Number)

 Ảnh hưởng dến quá trình lên men:

- E. coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E. coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E. coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc lên men rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên men nhanh lactose (như Kiebsiella, Enterobacter, Serratia cà Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform. - E. coli có khả năng sinh indole. Không sinh H2S.

 Thứ nhất: Trong quá trình lên men, nếu có chứa E.coli nói riêng, Coliforms nói chung vượt quá mức quy định theo TCVN thì chứng tỏ nguyên liệu nhãn đầu vào không đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm

– Thứ 2: Như đã nói, Coliforms là một con vi khuẩn có khả năng lên men đường Lactose và tạo khí indol – có mùi phân => Qúa trình lên men bị ảnh hưởng, tạo mùi khó chịu.

 Cách khắc phục:

- Kiểm tra lượng Coliforms ngay từ khâu nhập nguyên liệu

 Trong nước ăn uống: hàm lượng E.coli và Coliform tổng số bằng 0 vi khuẩn/100ml.

(QCVN 01:2009/BYT)

 TCVN 6848:2007:tiêu chuẩn Việt Nam,xác định coliforms có trong hoa quả  ISO 4832:2007:Tiêu chuẩn quốc tế, xác định coliforms có trong hoa quả

 TCVN 7924-2:2008:tiêu chuẩn Việt Nam,xác định E.coli có trong hoa quả  ISO 16649-2:2001::tiêu chuẩn quốc tế,xác định E.coli có trong hoa quả

– – Hình 6.2 Coliforms – Hình 6.2 Coliforms – – Hình 6.3 E.coli – 1.3.Staphylococcus aureus (22)

- VK hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, hình cầu, Gram dương, có thử nghiệm coagulase, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, sucrose.

- Sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy 100°C trong 30 phút.

- Gây triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy kéo dài

–

– Hình 6.4: Staphylococcus aureus Ảnh hưởng dến quá trình lên men: (23)  Ảnh hưởng dến quá trình lên men: (23)

- Trog quá trình lên men, Staphylococcus Aureus có khả năng lên men và tạo acid từ đường sucrose

- Tương tự, việc tạo acid sẽ tiêu tốn môi trường, tạo acid làm chua rượu, đổng thời acid tạo ra có thể hạn chế sự sinh trưởng của con Saccharomyces cerevisiae, hoạt lực lên men giảm.

 Khắc phục:

- Để ngăn chặn sự phát triển của S.aureus và sự hình thành độc tố ruột:

– Đảm bảo thực phẩm được duy trì ở nhiệt độ cao trên 60o C (> 140 ° F) và bảo quản thực phẩm lạnh dưới 4o C(<40 ° F).Do S.aureus có khả năng phát triển trong các sản phẩm thực phẩm ở một phạm vi nhiệt độ rộng (45-118ºF; tối ưu 85-99ºF), pH (4,2-9,3; tối ưu 7-7,5 ), và nồng độ natri clorua (lên đến 15% NaCl)

- Sử dụng dung dịch sát khuẩn tự nhiên Sanodyna trong tất cả quá trình chế biến thực phẩm. (23)

a. Samonella (24)

- Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý,có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indol, không phân giải ure, hầu hết đều sinh H2S.

- Gây ngộ độc thực phẩm với các triệu chứng tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn - Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc hoặc MPN

 Ảnh hưởng đến quá trình lên men

- Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, indol âm tính, đỏ methyl dương tính, VP âm tính, citrat thay đổi, urease âm tính, H2S dương tính (trừ Salmonella

paratyphi A: H2S âm tính)...

 Do Samonella có khả năng lên men đường glucose nên làm tiêu hao chất dinh dưỡng, cạnh tranh môi trường sống với các con nấm men cần thiết trong quá trình lên men => hiệu suất lên men giảm

– Đồng thời tạo các khí có mùi thối => quá trình lên men xem như hỏng.

–

 Cách khắc phục:

- Bảo quản lạnh ngay nếu chưa sử dụng

- Kiểm tra chất lượng đầu vào trước khi đưa vào chế biến

–

– Hình 6.5 Samonella

 Phương pháp đếm đĩa petri (25)

a) Chuẩn bị môi trường

– Hòa tan các thành phần môi trường trong nước, phân phối môi trường vào chai thích hợp. Khử trùng ở 121oC 1atm trong 15 phút. Trước khi kiểm tra vi sinh vật cần làm tan chảy hoàn toàn môi trường agar bằng nhiệt (bếp điện hoặc lò viba)

–

– Hình 6.6: đĩa petrib) Cách tiến hành b) Cách tiến hành

 Yêu cầu chung

– Mọi việc chuẩn bị và các thao tác bằng tay cần được thực hiện với kỹ thuật vô trùng. Và dùng dụng cụ cần được vô trùng để tránh nhiễm vi sinh vật từ các nguồn bên ngoài vào mẫu.

 Cách bước tiến hành: – Đối với các mẫu rắn:

- Bước 1:

– Cân 25g mẫu vào bình Erlen chứa 225 ml dung dịch pha loãng đã khử trùng để được độ pha loãng 10-1.

– (Lưu ý: Sau khi hòa mẫu vào dung dịch pha loãng, nên đồng nhất mẫu trên máy lắc trong 20 – 30 phút trước khi tiếp tục pha loãng nồng độ 10-2)

- Bước 2:

– Hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ 10-1 lần lượt vào dãy ống nghiệm 9ml để được các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3,10-4,…,10-n tùy theo yêu cầu.

– (Lưu ý: Trước khi pha loãng nồng độ tiếp theo nên votex độ pha loãng trước đó để đồng nhất mẫu.)

- Bước 3:

– Hút 1ml dịch pha loãng ở từng nồng độ cho vào đĩa petri. – (Lưu ý: Nên kiểm tra ở 3 nồng độ pha loãng)

- Bước 4:

– Thêm vào mỗi đĩa petri khoảng 12 – 15 ml môi trường thạch ở nhiệt độ từ 44 – 47oC. Trộn đều dịch pha loãng với môi trường bằng cách xoay đĩa petri và để hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa petri trên bề mặt nằm ngang ở nơi mát. – (Lưu ý: Tránh để môi trường thạch xuất hiện bọt khí khi đổ đĩa)

– Sau khi hỗn hợp đông đặc hoàn toàn, lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và đặt vào tủ ấm ở (30 ± 1)oC. Ủ trong 48 giờ.

– Đếm khuẩn lạc:

– Sau giai đoạn ủ, giữ lại các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 đến 300 khuẩn lạc. Khi đếm khuẩn lạc, chỉ đếm những khuẩn lạc đặc trưng cho chủng vi sinh đang quan tâm, tránh đếm nhầm bọt khí và các hạt không hòa tan trên mặt thạch.

– Phương pháp tính:

– Tính số lượng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng Công thức:

– ∑C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng liên tiếp. Trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc.

– n là số lượng đĩa petri được lựa chọn để tính tổng số khuẩn lạc – V là thể tích mẫu được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng ml

– d là độ pha loãng tương ứng. –

 Phương pháp MPN

– –

– Hình 6.7: Phương pháp MPN – –

- Phương pháp Most Probable Number (MPN) Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 5 x 3 = 15 ống nghiệm.

– – – – – – – – – – – –

- Quy trình thực hiện như sau: –

– Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

– – – –

– Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

– – –

– Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định định Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng

– – –

– Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng , tra bảng Mac Crady

– –

– Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu

– – – – – –

– – – – – –

2. Các vi sinh vật và vi khuẩn ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.1.Lactobacillus species (27)

– Tạo ra các amin sinh học gây hư hỏng – – Histamine (28)

– – Cadaverine (29) – – Putrescine (30) – – Tyramine (31)

– Làm chậm quá trình lên men (27) – – Heterofermentive Lactobacillus spp. – – Homofermentive Lactobacillus spp.

– Vì;Giúp giảm thiểu nguy cơ sản xuất axit axetic. L. plantarum được tìm thấy để xử lý một hệ thống enzym phức tạp hơn, có thể đóng vai trò trong việc điều chỉnh hương thơm Để vi khuẩn phát triển đến mật độ tế bào đủ cao để phân hủy nhanh chóng mạch nha có trong sản phẩm Biogenic amines: Tạo ra các amin sinh học có hàm lượng cao gây hư hỏng và độc cho con người

– – Histamine :

– Gây ngộ độc con người, tăng huyết áp (Cực kì nghiêm trọng, ung thư)

– – Cadaverine : là một hợp chất diamine có mùi hôi được tạo ra do sự thối rữa của mô động vật. Cadaverine là một diamine độc hại có công thức NH (CH ) NH , ₂ ₂ ₅ ₂ tương tự như NH (CH ) NH của putrescine. Cadaverine còn được gọi với tên ₂ ₂ ₄ ₂ 1,5-pentanediamine và pentamethylenediamine.[2]

– – Putrescine : một hợp chất hữu cơ có công thức NH (CH ) NH . Một chất lỏng ₂ ₂ ₄ ₂ không màu, nó có liên quan đến cadaverine; cả hai đều được tạo ra bởi sự phân hủy các axit amin.Cùng với Cadaverine tạo mùi hôi thối hư hỏng sản phẩm

– – Tyramine :Gây ngộ độc, ung thư và tăng huyết áp nếu hàm lượng cao –

–

– Hình 6.8 Lactobacillus species2.2.Pediococcus species (26) 2.2.Pediococcus species (26)

– Pediococcus damnosus: có thể gây ra ‘ropiness’- là độ quánh ,nhờn của sản phẩm – Pediococcus parvulus: loài vi sinh vật sống ở điều kiện ưa ấm

– Cả 2 đều tạo ra những amin sinh học gây hư hỏng sản phẩm

– – Histamine : Histamine là một amin sinh học, có công thức hoá học là C5H9N3, được tạo thành trong quá trình chuyển hoá axit amin histidine dưới sự xúc tác của enzyme L-histidine decarboxylase. Có tính hút nước, chịu được nhiệt độ cao, không bị phân huỷ trong quá trình đun nấu thức ăn. Khi hàm lượng histamine trong thức ăn quá cao, hoặc enzyme phân huỷ histamine (acetaldehyde, histamine-N-

methyltransferase và diamine oxidase) trong cơ thể bị ức chế thì histamine sẽ gây độc cho cơ thể.

– – Cadaverine : là một hợp chất diamine có mùi hôi được tạo ra do sự thối rữa. công thức NH 2 (CH 2 ) 5 NH 2.

– – Putrescine: là một hợp chất hữu cơ có công thức NH 2 (CH 2 ) 4 NH 2 . Một chất lỏng không màu, nó có liên quan đến cadaverine.Cả hai đều gây ra mùi hôi khó chịu cho sản phẩm.

– – Tyramine: Trong thực phẩm, nó thường được sản xuất bởi sự khử carboxyl của tyrosine trong quá trình lên men hoặc phân rã. Lượng tyramine cao có thể gây ra một số vấn đề sức khỏe, phổ biến nhất là chứng đau nửa đầu. Những người bị chứng đau nửa đầu thường chọn tránh các thực phẩm có chứa tyramine. Mức độ cao của tyramine trong cơ thể cũng có thể gây ra huyết áp cao.

–

– Hình 6.9 : Pediococcus species Biện pháp khắc phục  Biện pháp khắc phục

– - Lựa chọn nguyên liệu ít bị hư hỏng tránh sự xâm nhập của vi sinh vật – - Bổ sung SO2 để ức chế hoạt động các vi sinh vật nói trên

– - Bổ sung chât dinh dưỡng để đảm bảo quá trình lên men diễn ra – - Điều chỉnh độ pH, axit

 Phương pháp phát hiện

– - Phương pháp PCR điện di gel dải nồng độ biến tính (PCR –DGGE): Xác định vi khuẩn bằng cách phát hiện DNA của chúng bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

– - Nên sử dụng phương pháp thạch MRS quy định trong TCVN 8177 (ISO 7889). Độ pH của môi trường phải trong khoảng từ 6,0 đến 6,4. Phải tiến hành ủ trong điều kiện kị khí ở 37 oC ± 1 oC trong thời gian 72 h.

3. Các nấm mốc ảnh hưởng đến quá trình lên men

3.1.Rhizopus oryzae:

- Là một loại nấm dị hợp,các túi bào tử phân tán trong không khí - Phát triển ở ngưỡng nhiệt từ 7oC-44oC,điểm nhiệt tối ưu là 37oC.

- Rhizopus oryzae được phân lập từ thực phẩm, Nó được tìm thấy trong trái cây và rau thối rữa.

–