- Cân nhắc trong việc lựa chọn nhà cung cấp nguyên liệu, coi trọng yếu tố chất lượng của nguyên liệu đầu vào
Hình 6.10 hình dạng nấm mốc Rhizopus oryzae
- Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và Phương pháp bổ sung
chlortetracycline clohydric
–+ Phương pháp bổ sung chlortetracycline clohydric
–Việc phát triển quá mức vi khuẩn có thể là một vấn đề (ví dụ: thịt tươi), do đó khuyến cáo sử dụng chloramphenicol (50 mg/l) và chlortetracycline (50 mg/l). Trong trường hợp nay, chuẩn bị môi trường cơ bản như trên nhưng chỉ sử dụng 50 mg chloramphenicol rồi phân phối các lượng 100 ml và khử trùng. Đồng thời chuẩn bị dung dịch Chlortetracycline clohydric 0,1 % (khối lượng) trong nước (vì dung dịch này không ổn định nên phải chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) và lọc để khử trùng. Ngay trước khi sử dụng, thêm 5 ml dung dịch này một cách vô trùng vào 100 ml môi trường cơ bản và đổ ra đĩa. Không khuyến cáo sử dụng gentamicin vì việc sử dụng gentamicin cho thấy ức chế một số loài nấm men.
Ảnh hưởng đến quá trình lên men:
–R. oryzae được biết là sản xuất L (+) - axit lactic vì tế bào nấm có khả năng chống chịu tốt hơn với nồng độ axit lactic tích lũy cao và hàm lượng chất dinh dưỡng cần thiết thấp hơn so với các quy trình vi khuẩn thường được sử dụng. Do đó, R. oryzaelà cách tiếp cận hiệu quả nhất để cải thiện quy trình sản xuất axit lactic tạo điều kiện tái sử dụng nhiều lần các tế bào nấm để sản xuất axit lactic lâu dài. Ethanol là sản phẩm phụ chính trong quá trình lên men R. oryzae trong quá trình sản xuất axit L-lactic. R. oryzae có thể được sử dụng như một chất xúc tác sinh học để sản xuất este trong dung môi hữu cơ.
– Ở 40 ° C, sự phát triển thuận lợi hơn cho việc tiêu thụ glucose, tuy nhiên điều này ảnh hưởngtiêu cực đến việc sản xuất axit d -lactic. Nồng độ glucose 15% là cần thiết đểtạo ra axit d -lactictối ưu. Quá trình sản xuất axit fumaric bị ngăn chặn trong môi trường có chứa nhiều hơn 6 gam NH4NO 3 trong mỗi lít và thuận lợi cho việcsản xuất axit d -lactic.
3.2.Eurotium rubrum
- E. rubrum thuộc họ gen được chia sẻ với chín loài Trichocomaceae khác - Một loại nấm nội sinh được phân lập từ mô bên trong thân của cây ngập
mặn Hibiscus tiliaceus
- Phương pháp xác định:
– + Xác định halotolerance
– Halotolerance của chủng E. rubrum CBS 135680 (Trung tâm đa dạng sinh học knaw-nấm) đã được thử nghiệm ở mức độ mặn tăng 0-90% DSW. Các mức tương ứng đã được chuẩn bị bằng NaCl và 1:1 MgCl2:NaCl, tương ứng (Bảngbổ sung1). Hệ thống treo bào tử (~ 102) được điều chế với 10% DSW, chứa Tween 20 (nồng độ cuối cùng 0,05%) được tiêm vào ba lần trên các tấm nước dùng Czapek- Dox (CzD, Sigma) có chứa nồng độ muối tương ứng. Sự tăng trưởng được ghi nhận về đường kính thuộc địa sau 7 ngày ủ bệnh, hoặc sau 15 ngày đối với những người không cho thấy hoặc trì hoãn tăng trưởng. Ngoài ra, sự phát triển của E. rubrum đã được thử nghiệm trong CzD lỏng ở độ mặn tương ứng. Một ml huyền phù bào tử (~ 103) được tiêm vào 100 ml môi trường lỏng trong 150 ml bình Erlenmeyer và ủ trên máy lắc quỹ đạo (150 r.p.m.) ở 27 °Ctrong 7 ngày. Sợi nấm được thu hoạch, lọc, sấy khô và cân.
– Để quan sát cấu trúc sinh sản, các slide thủy tinh vô trùng đã được đưa vào nuôi cấy trưởng thành của E. rubrum trong phương tiện gy lỏng (glucose 10 g l−1, chiết xuất men 1 g l−1) bằng cáchsử dụng điều kiện muối như mô tả (0–100% DSW) ở trên và ủ trong 1 tuần. Sau đó, các slide đã được phục hồi và kiểm tra bằng kính hiển vi ánh sáng để tăng trưởng và hình thành các cấu trúc sinh sản và bào tử, và được chụp ảnh bằng Mắt điện tử MD130.
– + Trình tự và lắp ráp
– Bộ gen E. rubrum được phiên mã và sắp xếp và giải mã gen theo công nghệ Illumina. Đối với bộ gen, nó được giải mã theo phương pháp Shotgun sequencing (Trong di truyền học, ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong nghiên cứu về quần xã vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường tự nhiên của chúng mà không cần phải phân lập và nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm), định lượng bằng PCR định lượng và được sắp xếp theo trình tự trên Illumina HiSeq 2000 ở định dạng đọc 2 × 100 bp. Mỗi tệp fastq được kiểm soát chất lượng được lọc để tạo tác / quá trình ô nhiễm và sau đó được lắp ráp với phiên bản phát hành AllPathsLG R39750 (ref). 32). Điều này dẫn đến việc lắp ráp 26,2 Mb trong 110 giàn giáo với độ sâu đọc 91,7 × Bộ gen ty thể được lắp ráp riêng biệt và dẫn đến lắp ráp vùng phủ sóng 39,7 × với hệ thống lắp ráp 51 Kb bao gồm hai tiếp giáp (màng bảo vệ).
– Hơn 318 triệu lần đọc RNASeq đã thu được cho phiên mã E. rubrum và ab initio được lắp ráp thành 30.179 tiếp giáp với một loạt các kích thước từ 100 đến 17.830 bp (trung bình là 370 bp). Trong số này, 92,49% được truyền tin đến lắp ráp bộ gen với 95% nhận dạng và độ bao phủ 80% cho thấy mức độ hoàn thiện cao của việc lắp ráp bộ gen được sản xuất.
Ảnh hưởng của quá trình
- Tăng hàm lượng axit amin có tính axit của protein
- Dư lượng axit cao hơn trong các protein
- Mặn Khắc phục
- Nước sạch và đun sôi ở 1005̊C trước khi sử dụng’ - Giảm độ mặn trong quá trình lên men
–
– Hình 6.11:Cấu trúc sinh sản của E. rubrum ở nồng độ muối cao
3.3.Eriosema chevalieri
- E. chevalieri thường được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
- Nó ở trong đất, trong các sản phẩm thực phẩm, hàng da, bông, hạt dầu và các sản phẩm khô khác và được coi là xerophilic (nấm mốc ưa khô).
- Phương pháp xác đinh: Nuôi cấy lắc bình – + Cô lập và duy trì vi sinh vật
– Eurotium chevalieri được cô lập từ môi trường đất vườn. Quá trình cô lập được thực hiện bằng phương pháp sàn lọc của Pollock et al. (1992). Các mẫu nước có huyền phù đất vô trùng trong 3 ngày ở 30 ° C, và sau đó 0·1 ml được chuyển sang 10 ml môi trường nấm cơ bản (pH 5·0). Sau 2 ngày,môi trường đất được để yên trong 20 phút để cho phép các hạt cát và huyền phù lắng xuống. Khoảng 10 μl từ phía trên, được làm rõ một phần, pha được lan truyền lên các tấm thạch có chứa glucose, 2·0%; amoni sunfat, 0·06%; dipotassium hydro orthophosphate, 0·5%; natri clorua, 0·1%; magiê sunfat, 0·04% và chiết xuất nấm men và 0·04% với pH 5·0. Các vsv được cô lập nuôi dưỡng trên cùng một môi trường ở 4 ° C trong bùn và cấy chuyền trong một tháng(tạo ra một mẫu nuôi vi sinh vật/mô/tế bào mới bằng cách chuyển một phần mẫu nuôi có sẵn vào một môi trường nuôi cấy mới). Nấm được đánh giá trên cơ sở đặc điểm hình thái và môi trường bằng cách sử dụng tiêu chuẩn(Kurtmam và Fell 1998). Hơn nữa, còn nấm được được cấy cbuyền từ trung tâm nhận dạng nuôi cấy, Viện Công nghệ Vi khuẩn (IMTECH) Chandigarh, Ấn Độ.
– + Chuẩn bị inoculum
– Một hệ thống treo tế bào đã được chuẩn bị bằng cách tiêm 1 ml 48 h nuôi cấy trong nước dùng dinh dưỡng 200 ml và ủ ở 30 ° C trong 24 h để đạt được sự tăng trưởng tích cực bao gồm 400 bào tử ml−1.
– + Lựa chọn môi trường nấm và tối ưu hóa các thông số để sản xuất pullulan – Các thông số quá trình - các yếu tố hóa lý và dinh dưỡng ảnh hưởng đến sản xuất pullulan - được tối ưu hóa riêng lẻ và độc lập với nhau. Hơn nữa, các điều kiện tối ưu hóa đã được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm tiếp theo theo thứ tự tuần tự. Để lựa chọn môi trường, hai phương tiện khác nhau đã được sử dụng để tối ưu hóa sản xuất pullulan trong các giai đoạn ủ khác nhau (5–85 h), tốc độ khuấy (5–50 nét tốithiểu −1), nhiệt độ (25–45°C) và pH (3–6·5). Môi trường được chọn sau đó được sử dụng để tối ưu hóa các nguồn carbon và nitơ để sản xuất pullulan. Các môi trường A và B, có thành phần (%): sucrose, 2·5; glucose, 1·0; chiết xuất nấm men, 0·5; amoni sunfat, 0·1; magiê sunfat, 0·05; dipotassium hydro orthophosphate, 0·1; kali dihydrogen orthophosphate, 0·2; Tween 80, 0·05 và magiê clorua, 0·09, có pH 5·0 và sucrose, 2·5; glucose, 1·0; ‐ chiết xuất nấm men, 0·5; amoni sunfat, 0·1; magiê sunfat, 0·05; dipotassium hydro orthophosphate, 0·1; kali dihydrogen orthophosphate, 0·2, có pH 5·0, tương ứng, được sử dụng để phân tích so sánh ở 0·5% inoculum và ủ trong 60 h ở 30 °C. Thời gian ủ bệnh được đánh giá trong các khoảng thời gian khác nhau (5–85 h) ở các phạm vi nhiệt độ khác nhau (25–45) và pH (3·0–6·5), để sản xuất pullulan riêng biệt. Để điều chỉnh pH của môi trường, sử dụng 1 mol l−1 HCl hoặc 1 mol l−1 Na2CO3. Ngoài ra, các nguồn carbon và nitơ khác nhau và nồng độ khác nhau của chúng trong môi trường tăng trưởng cũng được đánh giá. Với mục đích này, môi trường đã được bổ sung các nguồn carbon khác nhau ở nồng độ 3% glucose, fructose, sucrose, mannose và xylose, và các nguồn nitơ của amoni sulfate, chiết xuất nấm men, natri nitrat, natri nitrit và histidine ở nồng độ 0·4%. Một thí nghiệm khác cũng được tiến hành để đánh giá tác dụng của các kết hợp khác nhau của các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ ở các nồng độ khác nhau để sản xuất pullulan bởi E. chevalieri trong môi trường cơ bản có amoni sunfat và chiết xuất men trong các kết hợp khác nhau như sau:
– Kết hợp A: 0·2% amoni sunfat + chiết xuất men 0·1%; Tổ hợp B: 0·3% amoni sunfat + chiết xuất men 0·2%; Tổ hợp C: 0·4% amoni sunfat + chiết xuất men 0·3% và Kết hợp D: 0·5% amoni sunfat + chiết xuất men 0·4%.
– + Điều kiện lên men
– Quá trình lên men được thực hiện trong các môi trường bình lắc chứa 250 ml môi trường sản xuất trong 1000 ml bình Erlenmayer được tiêm 0·5% inoculum và được giữ trong máy lắc lồng ấp 25 phút 25 phút-1 trong 60 h ở 30 ° C, và sau đó cả hai phương tiện truyền thông được phân tích riêng để sản xuất pullulan theo tất cả các thông số vật lý và dinh dưỡng khác nhau.
– Sau khi lên men, môi trường nuôi được làm nóng ở 100 ° C trong bồn nước trong 15 phút, làm mát đến nhiệt độ phòng và ly tâm ở 9660 g ở 4 ° C trong 10 phút để loại bỏ tế bào và các kết tủa khác. Ba mililit của supernatant đã được chuyển đến một ống
nghiệm, và sau đó 6 ml ethanol lạnh (tuyệt đối hoặc 95% ethanol) đã được thêm vào và trộn kỹ và giữ ở 4 ° C trong 12 h để kết tủa polysaccharide ngoại bào. Sau khi loại bỏ ethanol còn lại, kết tủa được hòa tan trong 3 ml nước
– khử muối ở 80 ° C, và dung dịch được lọc chống lại nước khử muối trong 48 h để loại bỏ bất kỳ phân tử nhỏ nào trong dung dịch. Exopolysaccharide đã được kết tủa một lần nữa bằng cách sử dụng 6 ml ethanol lạnh, và sau đó ethanol dư đã được loại bỏ, và kết tủa được sấy khô ở 80 ° C đến trọng lượng không đổi(Badr Eldin et al. 1994). ‐ Trọng lượng pullulan được thể hiện bằng g l−1.
– + Thủy phân polysaccharide ngoại bào tinh khiết và xét nghiệm giảm đường – Để kiểm tra độ tinh khiết và bản chất của polysaccharide được sản xuất bởi E. chevalieri, quá trình thủy phân enzyme của pullulan với pullulanase được so sánh với pullulan tinh khiết (Hóa chất Sigma, St Louis, MO, Hoa Kỳ) cùng với pullulan được sản xuất bởi A. pullulans. Chất nền hòa tan được thủy phân bằng cách ủ 0·5 ml (1 mg ml−1) của chất nền, 0·4 ml 0·2 mol l−1 Na2HPO4, dung dịch đệm axitcitric 0·1 mol l−1 (pH 5·0) và 0·1 ml pullulanase (Sigma) cho 21 h ở 40°C, (Su1986). Đường giảm được giải phóng được xác định bằng phương pháp axit di-nitro salicylic (DNS) biến đổi (Lee et al). 1999) để xác nhận pullulan.
– + Phân tích thống kê
– Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, và các giá trị trung bình được tính toán với độ lệch chuẩn
Ảnh hưởng đến quá trình lên men
- Tạo ra cacbon và nitơ kém hơn Aureobasidium pullulans và do đó có thể hữu ích cho việc sản xuất lên men
- Là một lợi ích bổ sung
KẾT LUẬN
– Kiểm soát vi sinh là một yêu cầu cần thiết đối với quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặt thiết bị... có thể đảm bảo sự an toàn liên tục của các sản phẩm thực phẩm dọc theo chuỗi cung ứng , đáp ứng các yêu cầu quy định và bảo vệ thương hiệu của nhà sản xuất.Càng ngày ngộ độc thực phẩm, bệnh truyền qua thực phẩm xảy ra ở quy mô rộng nhiều quốc gia càng trở nên phổ biến, việc phòng ngừa và xử lý vấn đề này ngày càng khó khăn với mỗi quốc gia và trở thành một thách thức lớn của toàn nhân loại. Phân tích vi sinh vật giúp đánh giá sự an toàn, kiểm soát ô nhiễm thực phẩm để phòng ngừa ngộ độc thực phẩm và bệnh truyền qua thực phẩm
–