- Cac hình ve dUric din theo [11,18,
2.2.3. Nghièn cùa mot s6 tfnh ehit eùa proteinaza òrong bién
- Ành hìxòag eua mot sÓ chéft dàc hiéu nhóm (EDTA, HgClj) dèa PA duqc
tién hành trén (Ga thach nhu sau: Chuin bi eie dung dich EDTA va HgQ2 vói càc nòng dò 2,4, 6 mM; tròn dich enzim vói dung dich ehit nghièn cthi theo ty le 1:1
{vfw\ ù hòn hqp trong 20 phtit ò nhiét dò phòng sau dó mói nhò vào (fia thach de
42
- Nghièn cùu khà nàng phàn giài càc ca chiikbàc nhau ò càc pH khàc nhau
duqc tiéa hành nhu sau: chuin bi càc dia thach riéng re chiìa co ehit (cazein hoac
gelatin, nòag dò 0,1%) ò càc pH khàc nhau (6,5 va 8,1). Che phim proteinaza vói
nòng dò xàe dinh duqc giò vào càc giébg tuong lìng trén (fia thach. Càc buóc tiép
theo làm nhu muc 2.2.1.2. Dành già, so sành miìc dò hoat dòng eùa enzim à càc
diéu kién da néu.
- Nghièn càu dò bAi nhièt cùa emJm: dung dich enzim duqc chuin bi trong
dich dém co pH thlch hqp. Cho vào càc òng nghiém nhò co nùt day, dàt càc òng nghiém ór càc nhiét dò 30°C, 40*^0, 50°C, 60°C, 70°C tnwig 30 phùt, sau dó làm nguòi dén nhiét dò phòng va tién hành xàe dinh PA trén dia thach, song song vói màu k h ^ g xù 1^ nhiét, nhu muc 2.2.1.2.
- Nghièn ctìu ành haòng cùa càc ion kim loai hóa tri 2 va mot sd chat khàc dén PA duqc tién hành nhu sau: dung dich càc ìoa kim loai Ca^"*", Cu^"*", Zn^"*", Cd^* duói dang muòi duqc chuin bi b nÓng dò 2.10"^M, riéng Hg^^ duqc pha ór
nÒngdò4.10'^M.
Càc ehit xistein, xistin, giutation khù duqc pha ò nòng dò 0,01 M; Na2S203, I2 - nòng dò 2.10' M; pHoaercaptoetanol - nòng dò 0,01%; p-cioromercuribenzoat - (p - CMB) nòng dò 2. lO'^M.
Càc ehit trén duqc ù vài enzim theo ty le 1/1 (v/v) trong 30 phùt ò nhiét dò
phòng sau dó dem xàe dinh PA song song vói màu khòng xù 1^ (nòng dò pha loàng gip dòi) theo phuong phàp khuéch tàn trén (fia thach duqc chuin bi vói co ehit cazein ò pH thfch hqp. Càc buóc tiép theo làm nhu muc 2.2.1.2.
2.2.4. Nghièn cùru mdt stf tinh ehit cùa lectin.
2.2.4. L Ành huòng cùapHdai boat dò lectin,
Dùng dém axetat de pha eie dung dich co pH tir 4 dèa 6, dilng dém photphat
hoàc Tris de chuin bi càc dém eó pH tir 7 dèh 10. Càc dung dich dém eó pH nhu
43
nhu dà trình bay cf muc 2.2.1.1. Dòi vói lectin tàch tur càc rong lue Enteromorpha
tubulosa va Ulva conglobata, thay vi dém tónh thuòng dùng dém eó ehùa CaQ2 de
thù.
2.2.4.2. Dò bel nhièt
Chuin bi mot so òng nghiém nhò eó nùt day va 200 |il dung dich lectin duqc
cho vào mói òng, day nùt va dàt à càc nhiét dò khàc nhau (30°, 40"*, 50*^, óO"", 70°, 80°, 90°Q trong 30 phùt Sau dó liy ra làm nguòi dèa nhiét dò phòng va tién hành
phan ùng ngung két hòng ciu nhu thuòng le.
2.2.4.3. Ành huòng cùa ion kim loai hóa tri 2.
Dung dich càc ion kim loai Ca^"*", N^^"*", Mh^"*" duói dang muòi eó eàe nòng dò khàc nhau (0,025; 0,05 ; 0,1; 0,2; 0,4 M) duqc pha trong càc dém thlch h<?p. Dùng càc dung dich dà chuin bi nhu trén de pha loàng lectin va hòng eiu va phàn
ùng ngung két duqc tién hành nhu dà tiinh bay à muc 2.2.1.1.
2.2.4.4. Tình dàc hièu dndng cùa lectin.
Duòng dàc hiéu cùa lectin duqc xàe dinh bang nghièn cùu su ùc che phàn ùng ngung két hòng ciu bài duòng. Chuin bi càc dung dich duòng nòng dò 0,4M trong dém eó pH thich hqp. 50 pi mói loai duòng duqc pha loàng gip dòi lién tiép trong càc giébg cùa bàn nhua vói dò pha loàng tu 1/2 dén 1/256 bang dém tuong ùng. Chuin bi mot dung dich lectin pha loàng chtìa 4 don vi ngung két/50 pi va 25 pi dich này duqc thém vào mói giéng eó ehùa duòng pha loàng trèn bàn nhua. DÒ yèn bàn nhua cr ntiiét dò phòng 30-60 phùt truóc khi thém vào mòi giéng 25 |il
hòng ciu 4% va bàn nhua lai duqc de yèn ò nhiét dò phòng thém 1 giò truóc khi
kiém tra dò ùc che. £>ò ùc che ngung két hòng ciu duqc ghi nhàn là dò pha loàng 1<^ nhit cùa dimg dich duòng con eó khà nàng ùc che hoàn toàn su ngung két hòng ciu. Dò pha loàng lón nhit cùa duòng ò day tuong ùng vói mot nÒng dò
44
nòng dò tòi thiéu cùa dung dich duòng con co khà nàng ùc che hoàn toàn su ngung két hòng ciu bòi lectin.
2.2.4.5. Xàe dinh khdi lugngphàn tur cùa lectin
Khòi luqng phàn tu eùa lectin duqc xàe dinh bang phuong phàp SDS - PAGE, gel 12 %, theo Laemmli [113], so sành dò di dòng tuc^fng dòi cùa lectin vói dò di dòng tuong dÒi eùa càc protein chuin.
Khòi luqng phàn tu cùa lectin dàc hiéu axit sialic tu rong lue Enteromorpha
tubulosa con duqc xàe dinh bang sic k^ l ^ g cao àp qua còt Superoza 12; càc
protein chuin duqc dùng eó khòi luqng i^iàn tùia: 20,43,78 kDa. De xàe dinh V^ cùa còt dà dùng blue dextran 2000.
2.2.5. Nghièn cùu mot so tinh. ehit (nia ehit Ùc che proteinaza.
2,2,5. L Ành huòng cùa nhièt dò dén hoat dò ùc che. Dò ben nhièt
Che pliim ehit ùc che proteinaza (PPI) sau tinh sach duqc xù 1^ ór 30°, 40°, 50°, 60°, 70°C trong 15 phùt, sau dó làm lanh nhanh ehóng bang nuóe dà. PIA eùa càc màu da xù ly nhiét duqc xàe (tình song song vói màu khòng xù 1^ theo phuong
phàp Anson cài tién nhu dà trình bay b muc 2.2.1.3.
Dò ben nhiét eira PPI duqc xàe dinh bang càch ù che phim ò 70°C trong càc khoàng thòi gian khàc nhau, sau dò làm lanh nhanh ehóng bang nuóc dà. Càc buóc tiép theo duqc tién hành nhu muc 2.2,1.3.
2,2.5.2. Tlhb dàc hièu enzim cùa ITI
PIA eùa càc che phim duqc xàe dinh vói tùng loai enzim: tripxin, e - kimotripxin, papain, theo phuong phàp Anson cai tién (muc 2.2.1.3), dùng dém photphat pH 7,4. Riéng dòi vói papain, dùng dém photphat 0,06M, pH 6,5 eó ehùa EDTA va xistein (ImM) de xàe dinh PA cùng nhu PIA; vói nÒng dò chuin là 0,125 mg/tal, enzim cho A OD = 0,20.
Hnh PIA va so sành hoat dò riéng cùa che phim dòi vói tùng enzim di dành già mùc dò &^c hiéu.
45
2,2.5,3. Nghièn cùu ành huòng cùa mot sdchài tói hoat dò ùc che.
Càc ehit duqc nghièn cùu là : giutation khù (0,2M), P - mercaptoetanol
(10%), urè (8M). Nghièn cùu ành huòng cùa eàe ehit trèn tói hoat dò ùc che cùa càc PPI duqc tién hành theo phuong phàp khuéch tàn trèn cfia thaeh (muc 2.2,1.2). Tròn che phim vói giutation khù (G), p - mercaptoetanol (M), uré (U) hoac hón
hqp tùng cap càc ehit trèn (G + M, U + G, U + M) ty le 1/1 (theo thè tleh), de b
60°C trong 20 phùt, sau dó làm lanh nhanh ehóng bang nuóc dà, ròi chuyén ve nhiét dò phòng, ù vói enzim tnróc khi giò lén (fia thach. Song song vói càc màu thi nghiém, tién hành làm eàe miu dòi chùng trong dó: chi eó ehit ùc che vói enzhn, ehi eó ehit nghièn cùu vói enzim va ca ehit ùc che va ehit nghièn cùru duqc thay bang dèm vói enzim.
Dành già ành huòng eùa càc ehit trén tói hoat dò ùc che cùa PPI dua vào kieh thuóc vòng phàn giài eùa eàe màu trèn (fia thach.
2.2.6. Nghièn cùu tuong tàc cùa proteinaza va lectin à rong bién vói càc
protein khàc
Nghièn cùu tuong tàc cùa proteiaaza va lectin b rong bién vói mot so protein
khàc duqc tién hành theo phuong phàp khuéch tàn trén dia thaeh (muc 2.2.1.2.).
Proteinaza tàch tu càc loài thuòc ehi Hypnea duqe thù tucmg tàc vói ehit ùc
che tàch tu ehfnh càc dòi tuqng dó va vói MPTl (ehit ùe che dac hiéu tripxin tu eày ho biu bi),
Lectin tàch tu hai loài rong lue Ulva conglobata va Codium arabicum duqc
thù trong tucmg tàc vói càc enzim: tripxin, a - kimotripxin, papain va proteinaza
46