- Cac hình ve dUric din theo [11,18,
2.2. PHUONG PHÀP NGHIÈN CÙU
2.2.1. Càc phucmg phàp xàe dinh hoat dò va dinh luqng protein
2.2.1.1. Xàe dinh hoat dò lectin bang phàn ùng ngung két tébào hóng càu
. Phàn uiig ngung két hóng càu duqc tién hành theo phuong phàp eùa Gebauer
[92] : 50 p.1 dich lectin /dich chiét rong hoac che phàm lecùn / duqc pha loàng gà*p dòi lièn tiép bang dung dich dèm tucoig ung, trong càc giéng eùa bàn thù bang nhua (Microtiter system, kieh thuóc 12 x 8 cm, góm 8 hàng mòi hàng 12 giéng)
va 50 ul hóng càu 2% ivjv) eùa càc nhóm màu nguòi (dà rùa 3-6 Un bang N a Q
0,15M) duqc thém vào mòi giéng. Két qua phàn ùng ngung két duqc ghi nhàn sau 60 - 90 phùt de yèn bàn nhua à nhiét dò phòng. Hoat dò ngung két (hièu già, viét tat là HA) là nghich dào eùa dò pha loàng lón nhà't eùa dich lectin con eó khà nàng ngimg két hoàn toàn luqng hóng càu dà thèm vào.
Trong mot so' thi nghiém vói rong Ulva conglobata, phàn img ngung két hóng càu duqc tièn hànii vói hóng càu qua xù ly bang enzim nhu dà tiinh bay b
34
2.2.1.2. Xàe dinh hoat dò eùa proteinaza va chat tic che proteinaza bang
• phuong phàp khuéch tàn trèn dia thach co ca chat
Hoat dò proteolytic (PA) va hoat dò tire che proteinaza (PIA) eùa dich chiét rong cùng nhu che phim protein sach, duqe xàe dinh bang phucfng phàp khuéch tàn trèn dia thaeh [117] vói cu chà't là cazein 0,1% cr pH 6,5; 7,4 (dèm photphat) va
pH 8,1 (dèm Tris) dùng nóng dò thaeh (agar-agar) 1,5%, tién hành xàe dinh b
nhièt dò phòng trong 15 giò dói vói enzun eùa rong bién va trong 5 giò dói vói tripxin, a - kimotripxin hay papain, sau dò nhuòm dia thaeh bang dimg dich amido den ICE 0,1%. Dành già hoat dò theo kieh thuóc vòng phàn giài khòng màu trèn nén xanh dàm.
2.2.1.3. Xàe dinh PA va PIA theo phuang phàp Anson cài dèh
PA va PIA cùng duqc xàe dinh theo phuong phàp Anson cài tién [62] dùng cazein 1%, dèm photphat pH 7,4, ù hónhqp phàn ùng 10 phùt b 30*C. Ò phàn ùng
xàe dinh PIA, enzim duqc pha ò nóng dò sao cho sau phàn tìng eó 0,2 < AOD < 0,3 (nóng dò ehuii) / tripxin vói nóng dò ehuin là 0,04 mg/mi co AOD = 0,25, a -
kimotripxin vói nóng dò 0,04 mgAnl co AOD = 0,22 /, thay vi 0,5 mi enzim (b
nóng dò chuàn), dùng 0,25 mi dich ehéphdm tròn vói 0,25 mi dich enzim eó nóng dò gtfp 2 làn nóng dò chuin va hón hqp duqc ù trong 10 phùt of 30''C. Tiép theo tién hành xàe dinh hoat dò PA nhu phuofng phàp da nói trèn.
Dua trèn già tri A OD eùa phàn ùng enzim khòng bi ùe che va phàn tìng enzun bi tìe che ta tinh duqc so don vi tìe che trèn Imi dung dich chat tìe che theo còng thtìrc sau:
(AODE-AODEI)
PIA/ml= a . 4 = so don vi (lU) A ODE
35
A ODEI : A OD eùa enxim bi tìe che. • a : So mg enzim trong phàn ting.
Mot dcm vi tìe che là luqng chat tìe che làm giam 50% hoat dòng eùa 2 mg enzun.
2.2.1.4. Hàm lagngprotein diracxàc dinh theoLowry vànnk[124]
2.2.2. Tinh sach càc protein co hoat tfnh sinh hoc tir rong bién.
2.2.2.1. Kà: tua protein bang amòn sulphat
Két tua protein bang càch thèm amon sulphat tinh thè vào dimg dich protein. Luqng amon sulphat càn thèm vào duqc tìaih theo còng thtìe sau:
0 , l . g . ( S 2 - S i ) x =
v . g
1 - .52 1000 1000
X : so luqng gam amon su^hat càn thèm vào 100 mi dung dich protein g : luqng amon sulphat eó trong 1000 mi dung dich bao hoà
Sj : Mtìc dò bào hoà ban dàu eùa dung dich protein càn két tua S2: Mtìc dò bào hoà càn dat duqe
V : Thè tich rièng eùa amon sulphat trong dung dich bào hoà
Thòng thuòng b 25**C g = 5363 gam thi (V. G)/1000 = 0,29
Mot luqng nhà^t dinh amon sx%hat tinh thè duqc thèm tir tir vào dung dich protein / vtìa thém vtìa khuày lièn tue / de dat dò bào hoà càn thiét. Sau khi amon sulphat tan hét tiép tue khuày 15 phùt ór nhiét dò phòng, sau dò de hSn hqp vào tu
lanh trong 2 giò hoàc qua dèm cho két tua lang hoàn toàn. Ly ttoi lanh ò 5000
v^hùt trong 30 phùt, thu lày két tua protein. Két tua nhàn duqc dem thim tich dói nuóc, sau dò dói dém eó pH nhà't dinh. Dich protein sau thim tich duqe dùng cho càc thi nghièm tiéjp theo.
36
Két tua bang amon sulphat duqc dùng de tinh sach scf bò protein eó hoat tinh
tur rong lue Enteromorpha tubulosa, thèm tinh thè amon sulphat vào dung dich
protein de eó dò bao hoà 60 va 100 %.
2.2.2.2. Siekyigcphàn tàtrùn còt Sephadex
Trèn cor so da so càc protein dang càu eó khói luqng phàn tu trong khoàng 50 - 100 kDa, chùng tòi dà chon Sephadex G-75 dói vói hàu hét eàe màu nghièn ctìu
va G-100 de tinh sach lectin tu rong rong lue Codium arabicum.
Còt Sephadex duqc chuin bi theo [64] nhu sau:
Càn mot luqng nhà^t dinh bòt gel (luqng càn tu}^ thuòc vào loai Sephadex va kieh thuóc còt duqc dùng), cho vào eòe, thèm vào dò nuóc hoac dèm tuong tìng vói luqng du thùa de làm truòng gel, Sau khi gel dà truòng ncr hoàn toàn, rùa gel vài làn vói nuóc hoàc dém bang càch lang gan de loai bò eàe hat nhò. Loai bot khi trong gel bang càch dun càch thuy 3 0 - 6 0 phùt hoac bang hùt chàn khòng. Gel duqc chuin bi nhu trèn dà san sàng de nhói còt,
Còt eó kieh thuóc 2 x 80 em duqe giù thàng dtìng trèn già, eó chtìa mot it nuóc hoac dém (1/5 - 1/6 thè tich còt). Qio gel lèn còt bang càch dò tu tu gel vào
theo thành c ò t Sau khi mot lóp gel dac ( 2 - 3 em) b day còt duqc hình thành, mò
khoà cho dung dìeh ehày tu ttì vói toc dò chàm ( 1 5 - 2 0 ml/giò). Néu gel trong eòe vàn con dó tiép lén còt, truóc khi dò càn khuày nhe lóp gel trèn màt còt de trành su phàn lóp. Sau khi da cho hét gel lèn còt, rùa va càn bang còt vói dung dich dém càn thiét Còt sau khi càn bang vói dèm ehay dà sfii sàng de tién hành sàc k$^.
Protein dua lén còt phài eó nóng dò khoàng 10 mg/mi; thè tich màu dua lèn còt bang khoàng 2 - 5% thè tich còt là tòt n h à t Sau khi màu dà thàm hét vào trong gel tràng phàn trén thành còt bang 3 - 5 mi dèm ehay va bàt dàu rùt protein. Càn chù ^ sao cho trèn mat gel luòn eó lóp dich dém cao 1 - 2 cm. Thu phàn doan 5 ml/óng (khoàng 2% thè tich còt) vói toc dò 20 - 30 ml/giò.
37
Còt gel eò thè su dung lai nhiéu làn sau khi dà xù ly. Néu còt gel khòng bi nén va khòng bi nhiém bin, thi ehi càn rùa còt bang dèm eó chtìa chà't ehóng khuin vói thè tich gap 2 - 3 làn thè tich còt. Truòng hqp còt gel bi nén hoàc nhiém b i n , càn thòi gel ra khòi còt, ngàm gel trong dung dich N a Q 0,5 M hoàc NaOH 0,1 N trong 2 - 3 giò, sau dó loc hùt chàn khòng, rùa tiép bang nuóe va cuòi cùng bang dém. Sephadex sau khi dà xù 1^^ nhu trèn, duqe dua lèn còt va viéc nhói còt duqc tién hành nhu da trinh bay trèn.
Néu gel chua su dung ngay hoac giù làu, càn phài thèm chat ehóng khuin vào dém r i a hoàc cho lén mat gel trén c ò t
2.2.2.3. Sic k^ trao dóiion trén còt DEAE - xenluloza (DEAE - xel)
Còt cho sàc ky duqe chuin bi theo [63] nhu sau:
Càn 15 - 20 gam bòt DEAE - xel, hoà vào 200 - 300 mi NaOH 0,1 N va
ngàm b nhiét dò phòng trong 1 giò. Sau dó de lang, gan bò nhùng hat nhò khòng
lang va loc hùt chàn khòng, rùa bang nuóc cho dén hét kiém. Tiép theo, thèm vào 100 mi HCl 0,1 N, khuày déu, loc hùt va lai rùa bang nuóe cho hét axit Cuòi cùng rùa mot làn bang dèm ehay sàc ky (dém eó lue ion thàjp). Sau dó Ià'y gel ra cho vào eòe, thèm vào 100 - 200 mi dèm ehay, de làng va gan bò hat nhò. DEAE - xel dà chuin bi nhu trèn duqc dua lèn còt (kieh thuóc 2,5 x 20 em) dà duqc kep thàng dùcag trèn già, bang càch dò tu tir vào theo thành c ò t Sau khi mot lóp DEAE - xel dac ( 1 - 2 cm) dà hình thành, mò khoà cho dich dèm ehay chàm (20 - 25 ml/giò). Dò tiép gel vào còt, din din tùng it mot, mòi lin truóc khi dò khuiy nhe lóp gel trén màt c ò t Trong qua trình nhói còt cùng nhu ehay sae ky phài luòn giù mot lóp dich dém cao 1 - 2 em trèn màt geL Sau khi dua hét DEAE - xel lén còt, càn bang còt bang càch rùa vói 100 - 200 mi dém ehay eó pH xàe dinh. Còt duqc chuin bi n h u trén dà sin sàng de ehay sàc ky.
Luqng protein dua lèn còt khòng qua 0,1 g trén 1 gam DEAE - xel. Sau khi dua màu lén còt, rùa còt bang dém ehay de tàch protein khòng h i p phu trèn còt (thu 1 0 - 1 5 phàn doan, mòi phàn doan 5 mi). Sau dó rùt protein h i p phti tu còt bang gradient lue ion. Trong tit eà càc tiuòng hqp déu dùng gradient muói N a Q
38
de rùt protein ra khòi còt vói toc dò 35 - 40 ml/giò, thu phàn doan 5 ml/óng, Xàe
dinh protein, HA hoac PA hoàc PIA b càc phàn doan thu duqe.
DEAE - xel duqe su dung lai nhiéu lin sau Ichi dà xù ly va nhói lai còt nhu
da tiinh bay b trèn.
2.2.2.4. Sic k^ ài lue trùn còt Muxin- Sepharoza 4&
Phuong phàp này duqc dùng de tinh sach lectin hèn két dac hiéu axit sialic
tir rong lue Enteromorpha tubulosa.
Còt Muxin - Sepharoza 4B duqe chuin bi theo [66] nhu sau : - 25 mg Muxin (glycoprotein tàch tir da day Iqn) duqe hòa tan trong 10 mi dèm NaHCOg 0,1 M pH 8,3 eó chtìa NaCl 0,5M (li tàm loai tua néu co). Càn 2 gam Sepharoza 4B (dà duqc hoat hóa bài CNBJ rùa gel bang H Q ImM (loc hùt) sau dó hòa gel vào lOml dém trén va nhanh ehóng tròn vói dung dich muxin dà chuin bi sin; hón
hqp duqc lac tròn nhe nhàng óf nhiét dò phòng trong 2 giò hoac qua dèm b 4°C de
muxin gàn vào sepharoza.
Khi thòi gian hét, rùa hòn hqp bang dung dich glixin 0,2M, pH 8,0, rùa tiép bang dém NaHCOa, sau dó bang dém axetat pH 4,0 co N a Q 0,5M va cuòi cùng bang dém NaHCOa. Lue này gel dà eó thè dùng de sàc ky (néu chua dùng cin gitì c Ò t g e l à 4 ° C - 8 * ' Q !
Muxin duqe dùng b day là protein nguyén ven (khòng qua xù ly bang enzim
hay axit). Còt muxin - sepharoza 4B duqc càn bang vói dém Tris - N a Q /tris 0,02M + N a Q 0,15M/ pH 7,5, eó chtìa CaQ2 0,2 M. Theo dòi su rut ra eùa protein bang mày tu ghi h i p thu of 280 nm.
HA duqe xàe dinh theo phuong phàp dà nói trèn (muc 2,2,1.1), ehi eó khàc là dùng dém Tris - N a Q co chtìa CaQ2 de pha loàng lectin cùng nhu hóng ciu.
2.2.2.5. Xàe dinh dò tinh sach eùa che phàm.
De kiém tra dò sach eùa che phim dà dùng phuong phàp dién di trèn gel polyacrilamit eó SDS (SDS - PAGE) trong diéu kién eó va khòng eó ehit khù theo phuong phàp eùa Laenunli [113] nhu sau:
39
A. Chuin bi càc dung dich :
a. Dung dìeh góc acrilamit 30 %
- Aacrilamit 30 g - N', N - metylen bis acrilamit 0,8 g - Thém nuóc cit dén 100 mi
Gitì dung dich trong lo m i n b 4°C
b, Dém Tris - SDS pH 6,8 (Tris 0,25 M) - Tris 7,6 g - SDS 0,5 g - Thém nuóc cit dèh 250 mi Chinh pHdén 6,8 bang H Q 1 N e. Dém Tris - SDS pH 8,8 (Tris 0,75 M) - Tris 22,7 g - SDS 0,5 g - Thém nuóe cit dén 250 mi Qiinh pH dén 8,8 bang H Q 1 N d. Dèm ehay dién di -Tris 1,2 g -Glyxin • 5,76 g - SDS 0,2 g Thèm nuóe dén 200 mi e. Dung dich SDS 10% -SDS I g Thém nuóc dén 10 mi
Co thè gitì ò nhiét dò phòng tói 6 thàng
f. Dung dich amon persulphat 10%
- Amon persulphat 0,5 g - Thém nuóe dén 5 mi Dung dich ehi pha truóc khi dùng