Trong mục (2.3.1.1) nhiều loại chitosan có khối lượng phân tử khác nhau đã được tạo ra bằng kỹ thuật cắt mạch bức xạ. Tuy nhiên sản phẩm chitosan chiếu xạ bao gồm các phân tử có khối lượng phân tử khác nhau với phân bố khối lượng phân tử tương đối rộng. Vì
a S S DD 3450 1650 100
53
vậy, cần phải áp dụng kỹ thuật tách phân đoạn để thu được các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử trong khoảng hẹp theo yêu cầu ứng dụng.
Một số phương pháp có thể được áp dụng để tách các phân đoạn polyme có khối lượng phân tử khác nhau như kỹ thuật tách các phân đoạn polyme theo tính tan, kỹ thuật tách bằng sắc ký, kỹ thuật điện di, sử dụng màng siêu lọc, màng thẩm tách, hoặc các phương pháp kết hợp lọc-ly tâm, điện thẩm tách với màng siêu lọc.
Chitosan là một polyme chỉ hòa tan trong môi trường axit, phương pháp kết tủa và siêu lọc là phương pháp hiệu quả nhất. Phương pháp kết tủa đòi hỏi phải sử dụng một số hệ dung môi khác nhau cho từng phân đoạn, và khó có thể tách biệt rõ ràng chính xác theo khối lượng phân tử xác định, trong khi, kỹ thuật siêu lọc lại đòi hỏi phải sử dụng các loại màng lọc có kích thước nhất định. Trên quy mô phòng thí nghiệm hiện có, luận án đã sử dụng kỹ thuật siêu lọc với các dụng cụ lọc ly tâm Centrprep để tách các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử phân bố trong các khoảng hẹp sử dụng màng có kích thước lỗ tương ứng với giới hạn khối lượng phân tử trung bình số (NMWL) 3, 5, 10, 30 và 50kDa.
Về nguyên tắc, vật liệu chitosan gồm các phân đoạn khác nhau được hòa tan thành dung dịch có nồng độ thích hợp, sau đó được lọc qua màng siêu lọc có giá trị NMWL cao nhất. Các phân đoạn có kích thước phân tử nhỏ hơn giới hạn khối lượng phân tử trung bình này được lọc qua màng. Phần chất tan giữ lại được làm giàu đến nồng độ lớn hơn. Phần chất lọc tiếp tục được đưa vào màng siêu lọc có giới hạn NMWL thấp hơn. Quá trình tách tuần tự theo kích thước lỗ của màng sẽ thu được các phân đoạn có phân bố khối lượng phân tử nằm trong giới hạn NMWL của hai loại màng kế tiếp nhau. Kỹ thuật này có thể thu được các dung dịch chitosan có phân bố khối lượng phân tử xác định, tuy nhiên sản phẩm thu được ở dạng dung dịch cần được tiếp tục làm giàu và làm đông khô hoặc kết tủa rồi sấy khô để thu được chế phẩm chitosan phân
đoạn.
a) Vật liệu và phương pháp
Chitosan chiếu xạ có khối lượng phân tử thích hợp (CTS14, CTS15, CTS16, CTS26, CTS 35 và CTS 36) thu được như ở phần trước được sử dụng làm nguyên liệu để tách các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Axit Axetic (glacial), ethanol (99,5%) được mua từ công ty hóa chất DeaJung (Gyonggi, Hàn Quốc). Potassium bromide, sodium acetate và amonium acetate được mua từ hãng Merck (Đức).
b) Dụng cụ, trang thiết bị
Dụng cụ lọc ly tâm Centrprep được mua từ công ty Nihon Milipore Ltd, (Nhật Bản), YM 3, YM 10, YM 30, YM 50 được ký hiệu tương ứng với giới hạn khối lượng phân tử trung bình số NMWL của nó. Đây là loại ống ly tâm có nắp khóa trang bị màng siêu lọc có kích thước xác định dùng làm sạch, làm giàu và khử muối các mẫu sinh học có thể tích từ 2 đến 15ml. Chúng cũng được sử dụng cho các ứng dụng lọc và tách các polyme, nhất là các polyme sinh học mà không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của chúng. Loại ống ly tâm siêu lọc
Nắp kín khí
Nắp xoắn khóa
Vai thu gom chất lọc Rãnh thông Phần gom chất lọc Giá đỡ màng lọc Phần chứa mẫu Đường định cỡ Hình 2.8: Dụng cụ siêu lọc Centrprep
54
này tương đối dễ sử dụng, tốc độ lọc cao, được thiết kế phù hợp với hầu hết các máy ly tâm có thể cung cấp ống ly tâm dung tích 50ml.
Như thấy trên hình 2.8, Centriprep gồm một phần chứa mẫu với nắp xoắn để khóa không cho mẫu dung dịch tràn ra, một ống góp chứa phần lọc có gắn màng xenlulo tái sinh Ultracel YM hút bám, cộng thêm một nắp đậy kín khí để tách mẫu. Thiết kế này cho phép quá trình lọc xảy ra đồng thời với việc lắng đọng các hạt mịn, không làm tắc màng lọc. Chẳng hạn, sử dụng dụng cụ centriprep với màng Ultracel YM-50 (giới hạn khối lượng phân tử trung bình số 50kDa, 15ml mẫu có thể được làm giàu tới 0,7ml chỉ sau 20 phút ly tâm. Thể tích mẫu nhỏ hơn sẽ đòi hỏi ít thời gian hơn. Vì tính hấp phụ thấp của màng, dễ dàng làm giàu được đến nồng độ cao. Thông thường trên 90% chất tan polyme được giữ lại. Để ngăn cản lọc đến khô hoàn toàn ảnh hưởng đến hoạt tính chất tan, một vòng chặn cỡ cố định gắn liền cung cấp thể tích mẫu làm giàu cuối cũng khoảng 0,6-0,7 ml.
Máy ly tâm Centrifuge (Hoa kỳ) có tốc độ quay tối đa 100.000 vòng / phút cùng hai hệ ống ly tâm dung tích 15 và 50ml.
Máy sấy chân không Shellab (Anh quốc), cùng bơm chân không với dải nhiệt độ hoạt động từ 30 đến 250C.
Hệ sắc ký thẩm thấu GPC Aligent với phần mềm xử lý ASTRA và các detector độ nhớt, detector tán xạ ánh sang, tử ngoại và detector khúc xạ với chỉ số khúc xạ 1.331. Pha động là hỗn hợp dung môi gồm axit acetic 0,2M / sodium axetate 0,1M có tốc độ dòng 1 ml/phút.
Thiết bị phổ hồng ngoại chuyển hóa Furrier (FTIR, Perkin Elmer Spectrum 2000, Anh quốc) với phần mềm xử lý phổ IR Spectrum 2.0.
* Phương pháp tách các phân đoạn của chitosan đã chiếu xạ
Bảng 2.4: Các phân đoạn chitosan tách từ mẫu chitosan chiếu xạ tương ứng
STT Nguồn gốc Phân đoạn tách được
1 CTS14; CTS15 CTS-PD1 (Mn~50kDa)
2 CTS15; CTS16 CTS- PD2 (Mn~30kDa)
3 CTS16; CTS26; CTS35 CTS-PD3 (Mn~10kDa)
4 CTS35; CTS26 CTS-PD4 (Mn~5kDa)
5 CTS36 CTS-PD5 (Mn~3kDa)
Các mẫu chitosan sau chiếu xạ được hòa tan hoàn toàn trong axit axetic 0,2M trên máy khuấy từ thành dung dịch chitosan 5% để tách thành các phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình số như trong bảng 2.4. Dung dịch chitosan được cho vào ống ly tâm Centriprep gắn kèm màng siêu lọc có giới hạn khối lượng phân tử trung bình số NMWL khác nhau. Đầu tiên, 15ml dung dịch chitosan được đưa vào phần chứa mẫu của ống lọc YM-50, đóng kín bằng nắp khóa. Bốn ống lọc
giống nhau được đặt vào máy ly tâm và ly tâm với
Hình 2.9: Tách chất tan với màng lọc
Đường định cỡ
Nắp kín khí
55
tốc độ 20.000 vòng/ phút trong 20 phút. Sau đó, chất lọc chứa các phân đoạn có Mn dưới 50kDa được gạn ra để riêng cho mục đích tách tiếp theo. Phần mẫu còn lại được làm giàu như trên hình 2.9. Để thu được dung dịch các loại phân đoạn khác nhau của chitosan, dung dịch mẫu được đưa vào lọc với các ống lọc có giới hạn khối lượng phân tử giảm dần.
Các dung dịch phân đoạn tách ra sau ly tâm được tiếp tục làm giàu và kết tủa trong ethanol. Rửa sạch vài lần bằng nước cất và sấy khô trong tủ sấy chân không ở 60C trong 24 giờ để thu được các mẫu chitosan phân đoạn. Tỷ lệ các phân đoạn thu được từ các mẫu chitosan khác nhau được xác định và hiệu quả của phương pháp tách siêu lọc cũng được đánh giá dựa trên lượng mẫu bị thất thoát trong quá trình tách. Đặc tính phân tử của mẫu chitosan phân đoạn được phân tích trên phổ hồng ngoại và sắc ký thẩm thấu GPC.
* Quá trình tách các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử khác nhau
Chitosan đã được đóng vào các túi PE, mỗi túi khoảng 100g và được chiếu xạ trên nguồn chiếu gamma với dải liều chiếu 25, 50, 75, 100, 200 và 500kGy như trong nghiên cứu trước. Một số mẫu chitosan chiếu xạ liều cao được sử dụng làm nguyên liệu đầu để tách các phân đoạn chitosan.
Đầu tiên, chitosan chiếu xạ được hòa tan hoàn toàn trong axit axetic 0,2M thành dung dịch 5%. Sau đó 15ml dung dịch này được đưa vào ống lọc ly tâm YM-50, ly tâm với tốc độ 1000g trong khoảng 20 phút trên máy ly tâm Centrifuge (Hoa Kỳ) để tách phần dung dịch polyme có khối lượng phân tử lớn hơn 50kDa, được ký hiệu là PD1. Dung dịch thu được tiếp tục được lọc ly tâm với ống lọc YM-30, thu được dung dịch chứa chitosan có khối lượng phân tử giới hạn trong khoảng 30~ 50kDa, ký hiệu là PD2. Tiếp tục quá trình như vậy thu được các dung dịch chitosan PD3, PD4, PD5 và PD6 có khoảng khối lượng phân tử 10~ 30; 5~ 10; 3 ~ 5 và < 3kDa tương ứng.
Các dung dịch chitosan được làm giàu và kết tủa trong ethanol. Rửa sạch vài lần bằng nước cất và sấy khô đến khối lượng không đổi trong tủ sấy chân không (Shellab, vương quốc Anh) ở 60C trong 24 giờ để thu được các mẫu chitosan phân đoạn. Tỷ lệ các phân đoạn thu được từ cùng loại chitosan chiếu xạ được xác định để đánh giá hiệu quả tách. * Đặc trưng của các phân đoạn chitosan
Các đặc tính phân tử của các mẫu chitosan phân đoạn được xác định bằng hệ sắc ký thẩm thấu (GPC-SEC, Aligent, Hoa Kỳ) trang bị các detector độ nhớt, tán xạ ánh sáng, tử ngoại và khúc xạ với chỉ số khúc xạ 1.331. Mẫu chitosan được hòa tan trong dung môi hỗn hợp gồm axit acetic 0,2M và natri axetat 0,1M thành dung dịch có nồng độ 2mg/ml, lọc qua màng lọc kích thước 0,22m trước khi bơm vào sắc ký. Hỗn hợp dung môi này cũng được sử dụng làm pha động trong quá trình chạy sắc ký, tốc độ dòng được đặt là 1ml/phút cho tất cả các mẫu phân tích. Phân bố khối lượng phân tử của chitosan được ghi lại trên sắc đồ, và được xử lý bằng phần mềm phân tích phổ ASTRA để xác định khối lượng phân tử trung bình và chỉ số đa phân tán của nó. Sắc đồ cũng chỉ rõ phân bố khối lượng phân tử của mẫu đo.
Cấu trúc phân tử của chitosan phân đoạn cũng được phân tích bằng phổ hồng ngoại chuyển hóa Furrier (FTIR, Perkin Elmer Spectrum 2000, Anh quốc). Chitosan sau khi sấy khô được trộn đều với KBr và ép thành mẫu có dạng đĩa mỏng. Mẫu được đặc vào giá để mẫu và phổ hồng ngoại được ghi lại sau khi đã loại bỏ nhiễu tín hiệu gây ra do không khí. Diện tích các đỉnh phổ được xác định bằng phần mềm phân tích phổ FTIR Spectrum 2.0. Mức độ deacetyl hóa của mẫu được tính theo công thức (2.2) mục (2.3.1.1).
Khả năng tan của các phân đoạn chitosan được xác định thông qua thời gian hòa tan tính theo phút của 1g mẫu chitosan trong 100ml nước hoặc các dung dịch axit axetic loãng.
56