- Sữa tách bơ
2.5.2.Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin nhị giá
2.5.2.1. Qui trình sản xuất nguyên dịch vacxin ựơn giá Viêm gan vịt và Dịch tả vịt
Hai loại virus nhược ựộc DTV thắch nghi trên phôi Vịt và VGV thắch nghi trên phôi gà và có các chỉ số sinh học ổn ựịnh, do ựó chúng tôi tiến hành sản xuất hai loại vacxin ựơn giá này tạo tiền ựề ựể sản xuất vacxin nhị giá.
Bước 1: Kiểm ựịnh và bảo quản giống
Trước khi ựưa vào sản xuất phải cấy chuyển virus vacxin qua phôi gà (ựối với virus VGV) và phôi vịt (ựối với virus DTV), các chỉ số ELD50, EID50 phải ổn ựịnh (ựộ lệch hiệu giá phải không quá 1/10). Kiểm tra ựặc tắnh của vacxin, giống virus vacxin phải ựảm bảo vô trùng, ựược giữ ở dạng ựông khô và bảo quản ở nhiệt ựộ - 800C.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
Bước 2: Chuẩn bị trứng
Phôi gà 10 - 11 ngày tuổi, phôi vịt 11- 12 ngày tuổi ựược lấy từ ựàn bố mẹ sạch bệnh. Lựa chọn những trứng có phôi khỏe mạnh, ựánh dấu vị trắ buồng hơi và ựầu phôi, ựể cấy virus sản xuất vacxin.
Bước 3: Cấy virus sản xuất vacxin
- Pha dung dịch giống:
Giống virút ở dạng ựông khô ựược pha trở lại bằng dung dịch PBS-, xử lý kháng sinh (cứ 1ml nước sinh lý cho 1mg streptomycine và 1000UI penicillin), pha thành nồng ựộ 10-2. Trộn ựều rồi ựể yên trong 30 phút ở 40C cho kháng sinh tác ựộng.
-Tiêm trứng và theo dõi:
Dùng dung dịch giống ựã pha tiêm vào xoang niệu mô của phôi. Khi tiêm ựưa kim qua lỗ ựã dùi chếch góc 450 sâu 1,5- 2cm, ựầu kim hướng về phắa ựầu phôi rồi bơm 0,1ml giống virus vào. Lấy parafin gắn kắn lỗ tiêm lại, ựể trứng nằm trên khay trứng và cho vào tủ ấp 370C ấp tiếp. Sau khi gây nhiễm 24h, 48h, 72h, 96h kiểm tra xem phôi trứng còn sống hay ựã chết. Loại bỏ những phôi chết trước 48h, chỉ thu những phôi chết trong khoảng 48-96h, bảo quản trứng ở 40C trong 8-12h ựể mạch máu co lại và làm trong nước trứng.
Bước 4: Thu hoạch, xử lý và bảo quản vacxin.
Lấy trứng ra khỏi tủ lạnh, lau khô, sát trùng,mổ trứng bộc lộ xoang niệu, xoang dương mô rồi thu lấy nước trứng, dùng panh gắp phôi ra hộp lồng ựể ựánh giá vacxin sơ bộ thông qua bệnh tắch của phôi. đối với vacxin DTV, nước trứng ựược thu vào các chai, bình chuyên dụng. Với vacxin VGV, nước trứng và thai ựược thu vào các bình và cơi ựựng vô trùng. Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của bán thành phẩm, bảo quản ở tử lạnh âm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
Hình 2.1. Tóm tắt quy trình sản xuất nguyên dịch vacxin nhược ựộc dịch tả vịt, viêm gan vịt
Ấp tiếp ở 370 C/96 giờ Thu trứng, ựể lạnh 40 C/12 giờ
Giống sản xuất
Pha với nước sinh lý thành nồng ựộ 10-2
Kiểm tra vô trùng
Gây nhiễm phôi trứng
Mổ trứng
Thu chất chứa virus
Bán thành phẩm Kiểm tra vô trùng
Chuẩn ựộ hiệu giá
Ra chai -> ựông khô, dán nhãn, bảo quản Kiểm nghiệm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
2.5.2.2. Qui trình sản xuất vacxin nhị giá
- Sau khi có ựược bán thành phẩm của hai loại vacxin, tiến hành kiểm tra chỉ tiêu vô trùng và kiểm tra hiệu giá vius của từng loại vacxin ựơn. Khi ựạt các tiêu chuẩn ta tiến hành phối trộn hai vacxin ựơn thành vacxin nhị giá.
- Với vacxin nhược ựộc VGV, tiến hành xay nhỏ, nhuyễn phôi cùng nước trứng, sau ựó phối trộn với bán thành phẩm của vacxin DTV, tiến hành lọc vô trùng rồi thêm chất bổ trợ, sao cho trong một liều vacxin có chứa ắt nhất 104 EID50 virus nhược ựộc dịch tả vịt chủng C và virus nhược ựộc viêm gan vịt type I, bổ sung kháng sinh theo tỷ lệ phù hợp
- Dùng máy chia tự ựộng hoặc seringer bán tự ựộng chia vào các lọ nhỏ ựông khô, ựậy nút, cho vào máy chạy ựông khô. Sau khi ựông khô vacxin ựược bảo quản ở nhiệt ựộ 4 - 8 0C.
2.5.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu theo 10 TCN 160 - 92 Vacxin thú y - Quy trình lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm
Mẫu kiểm nghiệm là các ựơn vị sản phẩm ựược lấy ra từ các lô vacxin ựể tiến hành kiểm nghiệm trước khi xuất sử dụng và lưu giữ trong thời hạn bảo quản của vacxin ựể giải quyết các tranh chấp nếu có.
- Mẫu ựược lấy theo lô vacxin. Lô vacxin là toàn bộ các sản phẩm ựược chia vào vật chứa cuối cùng, từ cùng một khối lượng vacxin ựồng nhất, trong cùng một ca sản xuất.
- Mẫu lấy theo phương pháp ngẫu nhiên theo tỷ lệ sau: + 10% sản phẩm (ắt nhất là 5) ựối với lô dưới 100 sản phẩm + 10% sản phẩm ựối với lô từ 100 ựến 500 sản phẩm
+ 2% sản phẩm ựối với lô từ 500 sản phẩm trở lên (nhiều nhất là 20 sản phẩm)
2.5.2.2.2. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng
Vacxin sau khi ựược sản xuất sẽ ựược kiểm tra vô trùng trên các môi trường thạch máu, thạch nấm (Sabouraud), nước thịt, nước thịt gan yếm khắ, .
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45 Mỗi lần kiểm tra, số lượng môi trường như sau.
- 4 ống môi trường thạch máu - 4 ống môi trường thạch nấm - 4 ống môi trường nước thịt
- 4 ống môi trường nước thịt gan yếm khắ
Ở mỗi lần, cho lần lượt 0,2ml vacxin vào từng ống môi trường trên ựể kiểm tra, rồi cho vào tủ ấm 37oC/ 7 ngày, lấy ra kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn.
* đọc kết quả:
- đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống môi trường mầu sắc môi trường không ựổi, không có tạp khuẩn và nấm mốc phát triển. Như vậy kết quả là âm tắnh, lô vacxin ựược coi là vô trùng.
- Nếu có một trong các ống môi trường có biểu hiện nhiễm trùng thì phải tiến hành nhuộm và soi kắnh ựể xác ựịnh loại vi khuẩn, ựồng thời kiểm tra lại lần 2 với số mẫu như trên. Nếu lần 2 không có vi khuẩn hoặc nấm phát triển thì mẫu ựược coi là âm tắnh.
- Nếu lần 2 cũng dương tắnh và cùng loại tạp khuẩn như lần 1 thì mẫu ựó ựược coi là dương tắnh. Lô vacxin có mẫu kiểm tra phải loại bỏ.
- Nếu lần 2 dương tắnh nhưng với loại tạp khuẩn khác thì phải tiến hành thêm lần 3 với cách thức như trên.
Riêng môi trường thạch nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng 25-30oC từ 5-7 ngày mới kiểm tra xem nấm có mọc không. Vacxin phải ựảm bảo vô trùng và không có nấm.
2.5.2.2.3. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Sử dụng vịt ở lứa tuổi mẫn cảm, khỏe mạnh, không nằm trong ổ dịch, chưa tiêm phòng vacxin dịch tả vịt và viêm gan vịt. Tiến hành tiêm vacxin cho vịt với liều tiêm gấp 10 lần liều sử dụng (nồng ựộ virus tương ựương
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46 104EID50 với 2 chủng virus trên). Sau khi tiêm theo dõi ựàn vịt trong 14 ngày. Vacxin ựược coi là an toàn nếu ựạt các yêu cầu sau: Con vật không có phản ứng phụ, không sốt hoặc chỉ sốt nhẹ, ăn uống hoạt ựộng bình thường.
- Trong phòng thắ nghiệm:
Tiến hành với 2 lô vịt con 3 ngày tuổi, mỗi lô 25 con, tiêm vacxin nhị giá dưới da hoặc bắp gấp 10 lần liều sử dụng; liều 0,2ml/con.
- Tại thực ựịa: bố trắ tiêm vacxin vừa sản xuất cho các ựàn vịt nuôi chưa ựược tiêm phòng vacxin dịch tả vịt và viêm gan vịt. Tiêm vacxin nhị giá dưới da hoặc bắp theo liều sử dụng, liều 0,2 ml với vịt con và 0,5ml với vịt to. Theo dõi các chỉ tiêu như trong phòng thắ nghiệm.
2.5.2.2.4. Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực và khả năng ựáp ứng miễn dịch của vacxin bằng phương pháp công cường ựộc
để kiểm tra hiệu lực của vacxin chúng tôi tiến hành phương pháp công cường ựộc. Việc công cường ựộc ựược tiến hành tại Xắ nghiệp thuốc Thú y Trung ương, ựảm bảo nghiêm ngặt và an toàn sinh học.
Công cường ựộc ựược tiến hành bằng vịt nuôi tại phòng thắ nghiệm của Xắ nghiệp và vịt nuôi ở thực ựịa.
* Vịt nuôi tại phòng thắ nghiệm của Xắ nghiệp: dùng vịt 1 ngày tuổi khỏe
mạnh chưa ựược tiêm phòng vacxin. Tiến hành làm thắ nghiệm 3 lần Mỗi lô dùng 30 con: 20 con thắ nghiệm và 10 con ựối chứng.
- Lô thắ nghiệm: tiêm vacxin nhị giá vào dưới da hoặc bắp mỗi vịt 1 liều vacxin với lượng 0,2 ml/con
- Lô ựối chứng: không tiêm vacxin
Tiến hành công cường ựộc:
Sau 14 ngày dùng giống virus viêm gan vịt cường ựộc TT Ờ 2006 (có LD50 = 10-7,56/0,2ml) tiêm cho vịt con với liều 1000LD50/0,2ml với lượng 0,2ml/con, theo dõi vịt ựến 30 ngày tuổi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47 Sau khi tiêm vacxin 21 ngày tiến hành công cường ựộc bằng virus cường ựộc dịch tả vịt chủng 769 (có LD = 10-9/ml) với liều 100 LD50/ml với lượng 1ml/con, theo dõi vịt trong 15 ngày sau khi tiêm.
* Vịt nuôi tại các cơ sở chăn nuôi: chúng tôi tiến hành tiêm vacxin cho
ựàn vịt 1 ngày tuổi của một gia ựình nuôi Vịt tại Thọ Xuân Ờ đan Phượng Ờ Hà Nội;
Sau khi tiêm 21 ngày, 60 ngày và 90 ngày tiêm vacxin chúng tôi bắt vịt về phòng thắ nghiệm của Xắ nghiệp và tiến hành công cường ựộc; dùng virus cường ựộc dịch tả vịt tiêm cho vịt với liều 100 LD50/ml với lượng 1ml/con, mỗi ựợt tiêm theo dõi trong 15 ngày. Tỷ lệ bảo hộ của vacxin ựược tắnh theo công thức sau:
Số vịt sống sau khi công cường ựộc Tỷ lệ bảo hộ ( %) =
Tổng số vịt theo ựược công x 100
Hiệu lực của vacxin ựược ựánh giá thông qua số vịt thắ nghiệm còn sống sau khi công cường ựộc và ựược bảo hộ với 2 loại bệnh trên.