2.4.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu SLGL trƣởng thành thu thập từ ngƣời và động vật Làm tiêu bản Chụp ảnh, đo đạc các chỉ số Tách ADN tổng số Nhận xét hình thể; so sánh hình thái SLGL nghiên cứu
với SLGL trên thế giới
Chạy PCR
Điện di kiểm tra trên gel agarose 2%
Chọn mẫu để tinh sạch ADN phục vụ giải trình tự
Giải trình tự trên máy tự động
Thu trình tự, phân tích trình tự thu đƣợc với trình tự chuẩn
Đối chiếu, so sánh kết quả phân tích hình thái và trình tự
gen
29
2.4.2. Cỡ mẫu phân tích
Cỡ mẫu theo nghiên cứu thống kê có ý nghĩa với n ≥ 30. Do đó, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu tối thiểu 30 mẫu ở mỗi tỉnh. Tổng số mẫu nghiên cứu ở 5 tỉnh là 150 mẫu.
2.4.3. Phƣơng pháp xác định kích thƣớc các chỉ số hình thái
Thu thập SLGL trƣởng thành và trứng sán thu đƣợc từ phân ngƣời và dịch mật từ túi mật của buồng gan động vật tại các điểm nghiên cứu. Con sán trƣởng thành và trứng đƣợc ngâm trong nƣớc muối sinh lý (NaCl 0,9%).
Kỹ thuật làm tiêu bản cố định mẫu SLGL trƣởng thành
Thu thập SLGL trƣởng thành và trứng từ bệnh nhân và lò mổ ở các điểm nghiên cứu. Các cá thể sán lá và trứng thu đƣợc sẽ đƣợc rửa chung trong nƣớc muối sinh lí (NaCl 0,9%) 3-4 giờ để đẻ bớt trứng.
Đặt sán lên lam kính sạch cố định bằng cồn 70°, phủ lá kính, cuốn chỉ và định hình trong cồn 70° trong 2 tuần trƣớc khi nhuộm.
Sán lá gan sau khi đƣợc cố định trong cồn 70° và thuốc nhuộm 15 – 30 phút cho đế nkhi có màu mận chín thì bỏ sán vào cồn axit.
Để mẫu SLGL trong cồn axit từ vài giây đến 5 phút cho đến khi sán có màu hồng. Quan sát bằng kính lúp để xác định xem các bộ phận bên trong sán đã rõ thì thôi. Nếu chƣa rõ thì phải để lại vào thuốc nhuộm.
Làm trong: từ cồn axit chuyển sán lần lƣợt sang cồn 80° rồi 90° - 96° từ 10 – 15 phút đối với mỗi loại cồn. Sau đó để giữ sán trong dung dịch xylen.
Gắn gôm, đặt lá kính lên sán (tùy theo độ dày của sán) để gắn chặt sán giữa lam và lá kính.
Sau đó đƣợc định loại bằng dấu hiệu hình thái đến giống hoặc loài theo khóa định loại và mô tả có sẵn của Urquhart (1996) và bảo quản trong cồn ethanol 70% cho tới khi tách chiết ADN tổng số [63].
Dựa vào khóa phân loại, căn cứ vào hình thái và kích thƣớc chiều dài, chiều rộng thân, giác miệng, giác bụng, buồng trứng, tinh hoàn của con SLGL đƣợc xác định thuộc loài F. gigantica (Cobbold, 1885), F. hepatica, giống Fasciola
(Linnaeus, 1785), họ Fasciolidae (Railliet, 1895), bộ Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937).
30
Dựa vào khóa định loại hình thể trứng SLGL theo Skrjabin và CS (1977) và Nguyễn Thị Lê và CS (1996).
Các chỉ số hình thể SLGL trong nghiên cứu này bao gồm: Chiều dài (BL), chiều rộng (BW), kích thƣớc giác bụng (VS), kích thƣớc giác miệng (OS), chiều rộng cổ sán (CW), chiều dài đầu sán (CL), khoảng rộng tinh hoàn (TW), khoảng độ dài tinh hoàn (TL), khoảng cách giác bụng đến cuối thân (VS – P), khoảng cách từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân (Vit – P).
Hình 2.2. Các chỉ số của sán lá gan lớn trƣởng thành [51]
31
Kỹ thuật xét nghiệm phân lắng cặn tìm trứng sán
Phƣơng pháp xét nghiệm phân lắng cặn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc miêu tả bởi Ash và Orihel (1987).
2.4.4. Các phƣơng pháp định loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử
2.4.4.1. Tiến hành phản ứng PCR-RFLP
Tách chiết ADN: Mẫu sán đƣợc tách chiết bằng DNeasy kit của hãng QIAgen, Mỹ theo quy trình của nhà sản xuất. Sản phẩm ADN sau tách chiết sẽ đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi dùng.
Cách tiến hành đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
Bƣớc 1: Ngâm mẫu trong PBS để loại bỏ cồn. Cắt một mẩu sán (khoảng 25 mg) hoặc sử dụng mẫu trứng sán thu từ ngƣời hoặc động vật.
Bƣớc 2: Mẫu SLGL đƣợc cho vào cối đá chuyên dụng và nghiền cùng với nitơ lỏng bằng chày chuyên dụng.
Bƣớc 3: Lấy bột thu đƣợc cho vào eppendorf 1,5ml và thêm 180µl dung dịch ATL (ATL buffer) vào.
Bƣớc 4: Thêm 20µl proteinase K, trộn đều bằng máy vortex và ủ ở nhiệt độ 56oC trong 5 giờ.
Bƣớc 5: Ly tâm ống chứa mẫu trong thời gian ngắn để làm những giọt nƣớc từ trên nắp bên trong tube rơi xuống.
Bƣớc 6: Thêm 200µl đệm AL, trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây, rồi ủ ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút.
Bƣớc 7: Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 giây.
Bƣớc 8: Thêm 200µl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây.
Bƣớc 9: Ly tâm 8000 vòng/phút trong thời gian ngắn.
Bƣớc 10: Cẩn thận chuyển hỗn dịch thu đƣợc ở bƣớc trên (bao gồm cả cặn) vào cột lọc sao cho không ƣớt ống.
Bƣớc 11: Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Đặt cột lọc trong một ống thu mẫu sạch loại 2ml và loại bỏ ống chứa phần nƣớc vừa lọc.
32
Bƣớc 12: Cẩn thận mở nắp cột lọc và thêm 500µl đệm AW1, để 1 phút ở nhiệt độ phòng. Đóng nắp, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút và loại bỏ cặn vừa ly tâm.
Bƣớc 13: Cẩn thận mở nắp cột lọc và cho vào đó 500µl AW2 để 1 phút ở nhiệt độ phòng. Đóng nắp và ly tâm 8000 vòng/phút x 1 phút. Sau đó ly tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng/phút trong 3 phút. Đặt cột lọc trong một ống ly tâm sạch loại 1,5ml và loại bỏ ống chứa dịch và ly tâm.
Bƣớc 14: Cẩn thận mở nắp ống và thêm 200µl đệm AE hoặc nƣớc siêu sạch. Bƣớc 15: Ủ ở nhiệt độ phòng thời gian 3-5 phút, sau đó ly tâm 14000 vòng/phút, bảo quản ADN ở -20oC.
Thực hiện kỹ thuật PCR-RFLP gồm 2 bƣớc: Bƣớc 1 thực hiện phản ứng PCR; bƣớc 2 sử dụng enzyme giới hạn cắt sản phẩm PCR vừa đƣợc nhân bản.
Bƣớc 1: Thực hiện phản ứng PCR để nhân bản đoạn ITS-2. Cặp mồi đƣợc thiết kế theo Mahami Oskouei và CS (2011) [47]. Trình tự mồi BD1: 5’ GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA 3’ và mồi ngƣợc. Trình tự mồi BD2: 5’ TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT 3’ và mồi ngƣợc, có kích thƣớc khoảng 1000 bp. Chu kỳ nhiệt là 950C/5 phút, tiếp theo 30 chu kỳ với 950C/30 giây, 61,60C/30giây, 720C/30 giây, chu kỳ cuối kéo dài 720C/7 phút. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 2% trong dung dịch đệm TBE 0,5X. Nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (1g/ml) 30 phút. Sau đó kiểm tra và chụp ảnh bằng hệ thống BioDocgel.
Bƣớc 2: Sử dụng enzyme giới hạn Tsp509I cắt sản phẩm PCR vừa nhân bản ở bƣớc 1. Thành phần phản ứng: 2 µl Fast digest buffer, 1 µl Tsp509I, 7 µl H2O, 5 µl ITS2-ADN. Điều kiện phản ứng: 65°C trong 10 phút.
Sản phẩm chạy điện di trên gel agarose 3% trong dung dịch TBE 0,5X, ở 25 volt trong 15 phút, rồi đƣa lên 50 volt trong 20 phút. Kiểm tra và chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh BioDocgel.
Kết quả chạy PCR đƣợc phân tích kích thƣớc trên thang chuẩn (100bp) do nhà phân phối cung cấp.
33
Bảng 2.1. Kết quả dự đoán sản phẩm ADN bằng các kỹ thuật PCR và PCR - RFLP
Tên loài
Sản phẩm nhân bản ITS-2 sau khi chạy
phản ứng PCR
Sản phẩm phản ứng cắt bằng
Tsp509I
F.hepatica 1000 bp 102, 171, 343 và 427 bp
F.gigantica 1000 bp 102, 171, 208, 219 và 343 bp
(thực tế ảnh chỉ nhìn thấy 4 băng tại các vị trí 102, 171, 213 và 343 bp)
F.hepatica/ F.gigantica
1000 bp 102, 171, 213, 343 và 427 bp
2.4.4.2. Giải trình tự gen
Sử dụng bộ kít tinh sạch ADN của hãng QIAgen. Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự gen tại công ty Cổ phần dịch vụ phân tích di truyền Gentis. Các mẫu đƣợc giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI3130. Trình tự gen đƣợc so sánh và đối chiếu với ngân hàng GENBANK. Xác định phả hệ dựa trên trình tự đoạn ADN bằng phần mềm Clustal W và MEGA6.
2.5. Xử lý số liệu nghiên cứu
Các số liệu thu thập trong nghiên cứu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê Y, Sinh học và sử dụng phần mềm Excel.
2.6. Đạo đức nghiên cứu
34
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả về hình thái của sán lá gan lớn tại các địa điểm nghiên cứu
Để phân biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica, các tác giả trƣớc đây thƣờng dựa chủ yếu vào các đặc điểm: Kích thƣớc của F. gigantica dài hơn, phần nhô lên của vai và phần đầu hình nón ngắn hơn, buồng trứng chia nhiều nhánh hơn, kích thƣớc giác bụng lớn hơn giác miệng…[40]. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng các chỉ số trên có khoảng gối lên nhau về mặt số lƣợng và kích thƣớc, do vậy trong nhiều trƣờng hợp khó phân biệt F. hepatica và F. gigantica. Thời gian gần đây một số nghiên cứu chỉ ra rằng các chỉ số BR (chu vi cơ thể), tỷ số BL/BW, VS-P có sự khác biệt rõ ràng, ít có khoảng gối lên nhau; nên đây đƣợc coi là các chỉ số hình thái có giá trị trong việc phân biệt F. hepatica và F. gigantica [59, 60].
Trong nghiên cứu này, để thu đƣợc các chỉ số hình thái của SLGL, chúng tôi áp dụng cách xác định các chỉ số của Urquhart và cộng sự (2006) [64]. Chúng tôi đã tiến hành đo đạc kích thƣớc 11 chỉ số hình thái của 150 mẫu SLGL thu thập đƣợc từ 5 tỉnh khu vực miền Bắc – Việt Nam (Hà Nội 30 mẫu, Nam Định 30 mẫu, Bắc Giang 30 mẫu, Nghệ An 30 mẫu, Thanh Hóa 30 mẫu). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
3.1.1. Kích thƣớc sán lá gan lớn ở động vật
Bảng 3.1. Kích thƣớc chiều dài và chiều rộng của sán lá gan lớn
Tỉnh n
BL (mm) BW (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 28 39 33,3±3,43 7,5 12 9,38±1,28 Hà Nội 30 29 42,3 35,15±3,85 8 14 10,18±1,36 Nam Định 30 27,6 41 34,42±3,26 7,7 13 10,24±1,24 Nghệ An 30 27 42 34,57±3,63 8 11 9,72±0,76 Thanh Hóa 30 27 41 35,0±3,59 8 11,2 9.86±0,82 Tổng 150 27 42,3 34,49±3,57 7,5 14 9,88±1,15
35
Kết quả đo kích thƣớc hình thái học của 150 mẫu SLGL đã đƣợc nhuộm Carmin (Bảng 3.1) cho thấy: hầu hết các mẫu sán có dạng thon dài, chiều dài của SLGL dao động từ 27 mm đến 42,3 mm (trung bình 34,49±3,57 mm), chiều rộng dao động từ 7,5 mm đến 14 mm (trung bình 9,88±1,15 mm).
Bảng 3.2. Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của sán lá gan lớn
Tỉnh n BL/BW Min Max TB Bắc Giang 30 2,33 4,67 3,6±0,52 Hà Nội 30 2,52 4,94 3,5±0,54 Nam Định 30 2,41 4,75 3,41±0,52 Nghệ An 30 2,5 4,33 3,57±0,43 Thanh Hóa 30 2,59 4,22 3,57±0,41 Tổng 150 2,33 4,94 3,43±0,49
Bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ BL/BW của SLGL dao động từ 2,33 đến 4,94 (trung bình 3,43±0,49).
Hình 3.1. So sánh tỷ lệ BL/BW của sán lá gan lớn tại 5 tỉnh miền Bắc 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 Bắc Giang Hà Nội Nam Định Nghệ An Thanh Hóa 2.33 2.52 2.41 2.5 2.59 4.67 4.94 4.75 4.33 4.22 Min Max
36
So với SLGL ở các nghiên cứu khác trong nƣớc và các nghiên cứu trên thế giới (Phụ lục 1), kích thƣớc chiều dài và chiều rộng của SLGL trong nghiên cứu này ở mức trung bình. Nghiên cứu của Nguyễn Quốc Doanh và CS (2006) tại Nghệ An và Cao Bằng cho kết quả kích thƣớc F. gigantica có chiều dài dao động từ 37,76 – 52,75 mm, chiều rộng dao động từ 10,49 – 14,46 mm (trung bình 12,45±1,01 mm); còn F. hepatica có chiều dài dao động từ 20,56 – 47,59 mm, chiều rộng dao động từ 8,79 – 15,52 mm (trung bình 11,74±1,43 mm) [5]. Theo Periago và CS (2008) nghiên cứu tại Hy Lạp cho kết quả chiều dài của F. hepatica là 15,48-28,71 mm (trung bình 23,73±0,33 mm), của Fasciola sp. là 23,46 – 45,4 mm (trung bình 33,88±0,34 mm), của F. gigantica là 35,25 – 48,71 mm (trung bình 44,65±1,15 mm) [60]. Nhƣ vậy, kích thƣớc SLGL trong nghiên cứu này có kích thƣớc trung bình so với một số nghiên cứu khác tại Việt Nam, Hy Lạp, Iran, Ai Cập. Sự khác biệt về kích thƣớc SLGL có thể do sự khác nhau của vật chủ mà sán ký sinh, mật độ sán nhiễm trong vật chủ…
Bảng 3.3. Chu vi giác bụng và giác miệng
Tỉnh n
Chu vi giác bụng VS (µm) Chu vi giác miệng OS (µm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 358,02 339,35 352,06±48,48 216,82 233,12 250,37±48,77 Hà Nội 30 236,86 439,78 385,9±36,13 182,12 336,7 248,43±43,05 Nam Định 30 327,103 459,51 404,03±34,79 164,3 325,99 259,88±40,02 Nghệ An 30 311,64 471,38 398,11±46,97 197,84 326,8 264,92±38,75 Thanh Hóa 30 317,9 458,61 400,34±44,32 201,84 358,18 281,57±41,76 Tổng 150 236,86 471,38 388,09±46,07 164,3 358,18 261,03±43,7
Chu vi giác miệng và giác bụng đƣợc tính theo công thức chu vi hình elip. Kết quả bảng 3.3 cho thấy chu vi trung bình của giác bụng lớn hơn của giác miệng. Cụ thể, chu vi trung bình của giác bụng là 388,09±46,07µm (dao dộng từ 236,86 µm đến 471,38 µm) và của giác miệng là 261,03±43,7 µm (dao dộng từ 164,3 µm đến 358,18 µm). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê khi sử dụng kiểm định ghép cặp (pair T-test), với CI 95%, p < 0,001.
37
Bảng 3.4. Kích thƣớc chiều rộng cổ và chiều dài đầu sán
Tỉnh n
Chiều rộng CW (mm) Chiều dài CL (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 3 4,5 3,67±0,48 2,5 4 3,16±0,45 Hà Nội 30 3 4,8 3,98±0,5 2,5 4,2 3,46±0,47 Nam Định 30 3,1 5,6 4,05±0,66 2,6 4,2 3,35±0,48 Nghệ An 30 3 5 3,78±0,53 2,5 4,2 3,3±0,44 Thanh Hóa 30 3 4,7 3,64±0,47 2,5 4 3,25±0,44 Tổng 150 3 5,6 3,82±0,55 2,5 4,2 3,3±0,46
Kích thƣớc trung bình của chiều rộng cổ sán là 3,82±0,55 mm (dao dộng từ 3 mm đến 5,6 mm). Kích thƣớc trung bình của chiều dài đầu sán là 3,3±0,46 mm (dao dộng từ 2,5 mm đến 4,2 mm).
Bảng 3.5. Kích thƣớc khoảng rộng và dài tinh hoàn
Tỉnh n
Khoảng rộng tinh hoàn TW (mm)
Khoảng dài tinh hoàn TL (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 5,1 7,8 6,49±0,75 16,5 24,1 19,08±2,48 Hà Nội 30 5 8 6,86±0,76 16 25 19,89±2,7 Nam Định 30 5,3 8 6,79±0,7 15 24 20,43±2,15 Nghệ An 30 5,7 8 6,73±0,56 17 23,6 20,2±2,12 Thanh Hóa 30 5,7 7,9 6,76±0,71 16 24 20,14±2,2 Tổng 150 5 8 6,72±0,7 15 25 19,95±2,36
Bảng 3.5 cho thấy kích thƣớc khoảng rộng tinh hoàn trung bình là 6,72±0,7 mm (dao dộng từ 5 mm đến 8 mm). Kích thƣớc khoảng chiều dài tinh hoàn trung bình là 19,95±2,36 mm (dao dộng từ 15 mm đến 25 mm).
38
Bảng 3.6. Kích thƣớc đoạn từ giác bụng đến cuối thân và đoạn từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân
Tỉnh n
VS-P (mm) Vit-P (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 25,7 37 30,54±3,33 6 13 9,36±2,2 Hà Nội 30 25,5 38 31,18±3,31 6,9 12,7 9,92±1,72 Nam Định 30 20,5 36 30,14±4,14 6,8 13 10,55±1,83 Nghệ An 30 26,7 35 31,32±2,18 7,8 14 11,1±1,57 Thanh Hóa 30 25 36 31,04±2,86 6,5 12,5 9,61±1,71 Tổng 150 25 38 30,85±3,22 6 14 10,11±1,9
Hình 3.2. So sánh tỷ lệ VS-P của sán lá gan lớn tại 5 tỉnh miền Bắc
Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.2 cho thấy khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân trung bình là 30,85±3,22 mm (dao dộng từ 25 mm đến 38 mm), khoảng cách từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân trung bình là 10,11±1,9 mm (dao dộng từ 6 mm đến 14 mm). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Bắc Giang
Hà Nội Nam Định Nghệ An Thanh Hóa 25.7 25.5 20.5 26.7 25 37 38 36 35 36 Min Max
39 Bảng 3.7. Sự phù hợp về loài sán theo chỉ số BL/BW và VS-P Loài sán Theo tỷ lệ BL/BW Theo VS-P n % n % F. hepatica-like 9 6 4 2,67 Fasciola sp.-like 51 34 9 6 F. gigantica-like 90 60 137 91,33
Theo tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán (Bảng 3.7) có 9 mẫu phù hợp với F. hepatica, 51 mẫu phù hợp với Fasciola spp., 90 mẫu phù hợp với F. gigantica.
Theo chỉ số VS-P, có 4 mẫu phù hợp với F. hepatica và 9 mẫu phù hợp với
Fasciola spp., 137 mẫu phù hợp với F. gigantica.
Hình 3.3. So sánh sự phù hợp về loài sán theo tỷ lệ (%) BL/BW và VS-P
Nhƣ đã nói ở trên, trong số các chỉ số hình thái của SLGL, các chỉ số BL, BW, VS-P và BL/BW là các chỉ số quan trọng để phân loại SLGL về mặt hình thái. Theo Periago và CS (2006) (Phụ lục 2), chỉ số VS-P ở F. hepatica là 12,4 – 25,08