Tiến hành phản ứng PCR-RFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn Tsp509I đối với các sản phẩm của phản ứng PCR, vì Tsp509I có thể tách riêng các loài Fasciola spp.. Enzyme này nhận biết chuỗi AATT trong ADN sợi đôi và cắt sau vị trí 0 trên mỗi mạch [47].
46
Kết quả ở hình 3.8 cho thấy trong số 150 mẫu con sán lá gan lớn trƣởng thành, chúng tôi thu đƣợc 150 mẫu bị cắt cho kết quả 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 213, 343 bp; không có mẫu nào bị cắt cho kết quả 4 băng ở các vị trí 102, 171, 343, 427 bp.
Hình 3.10. Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng BGS1
Hình 3.9 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 290 đến 340) của mẫu BGS1 có tín hiệu rõ nét.
47
Kết quả ở hình 3.10 cho thấy mẫu THT2 bị cắt cho kết quả 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 343, 427 bp.
Hình 3.12. Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng THT2
Hình 3.11 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 220 đến 270) của mẫu THT2 có tín hiệu rõ nét.
Trong số 150 mẫu trứng sán thu từ dịch mật của buồng gan trâu bò có 01 mẫu thu tại Thanh Hóa khi cắt bằng enzyme Tsp509I cho kết quả 4 băng tƣơng ứng là: 102, 171, 343, 427 bp và 149 mẫu còn lại bị cắt cho 5 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 208, 219, 343 bp; không có mẫu nào bị cắt cho 5 băng tại các vị trí 102, 171, 213, 343 và 427 bp. Kết quả trên cho thấy mẫu trứng sán lá gan lớn thu tại Thanh Hóa là F. hepatica, 149 mẫu còn lại là F. gigantica. Nhƣ vậy, đa số trâu bò tại 5 tỉnh miền Bắc nhiễm F. gigantica, một số ít trƣờng hợp nhiễm F. hepatica. Kết quả này trùng với kết quả của Lê Thanh Hòa (2007) [16], Nguyễn Thị Giang Thanh (2010) [22].
48
Hình 3.13. Sản phẩm PCR-RFLP của các mẫu sán cho kết quả F. gigantica/F. hepatica (mẫu NA6)
Trong số 14 mẫu trứng sán trên ngƣời có 13 mẫu bị cắt cho 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là: 102, 171, 213 và 343 bp và 01 mẫu bệnh nhân tại Nghệ An (mẫu NA6) sau khi bị cắt cho ra 5 băng tại các vị trí 102, 171, 213, 343 và 427 bp.
49
Hình 3.13 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 290 đến 340) của mẫu NA6 có tín hiệu rõ nét.
Trong số 314 mẫu phân tích có 312 mẫu sán và trứng sán là F. gigantica; 01 mẫu trứng sán trên trâu bò tại tỉnh Thanh Hóa là F. hepatica; 01 mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An là F. gigantica/ F. hepatica. Kết quả này cho thấy mẫu sán trên ngƣời có dạng lai F. gigantica và F. hepatica, lý do có thể đây là sự thích nghi của sán trên vật chủ ký sinh là ngƣời. Kết quả này giống với kết quả của Mahami Oskouei và CS (2011) [47], Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) [22], Nguyễn Thu Hƣơng và CS (2012) [20].
Trong kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) cho thấy điểm khác biệt trong việc sử dụng chỉ thị gen di truyền. Khi sử dụng chỉ thị gen
COX 1 (thuộc hệ gen ty thể), các gen không biến đổi và di truyền theo dòng mẹ là
F. gigantica, trong khi đó nếu sử dụng chỉ thị ITS-2 (thuộc hệ gen nhân) đã xác định đƣợc loài mới là dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica [22]. Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi đã đóng góp thêm bằng chứng về dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica trên vật chủ là ngƣời (tại tỉnh Nghệ An).