Hình 3.21. Sơ đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ phả hệ dựa trên trình tự đoạn gen thu đƣợc của SLGL trong nghiên cứu với SLGL ở một số nƣớc trong khu vực và
trên thế giới
(*Kết quả đã công bố mẫu dạng lai theo Le et al, 2008 [44]; **Kết quả đã công bố mẫu có chứa trình tự ITS – 2 của cả 2 loài F. gigantica và F. hepatica theo Le et al, 2008 [44];
***Kết quả đã công bố mẫu con lai theo Se – Eun Choe, 2011 [61])
Fasciola sp. Japan (AB207150) Fasciola hepatica Korea (HQ821448) Fasciola hepatica Ireland (AB207148) Fasciola hepatica Spain (AJ272053) Fasciola hepatica Australia (EU260058) FspN.a VN (EU260073)* FspCB2.a VN (EU260065)* FspBD1.a VN (EU260062)* FspNA.a VN (EU260071)* FspFG2.a VN (EU260067)* FspFG1.a VN (EU260066)* FspCB1.a VN (EU260064)* FspH1.a VN (EU260068)*
Fasciola hepatica Uruguay (AB010974) FspH2.a VN (EU260069)*
1696507 THT2 (H5) BD1
Fasciola gigantica Zambia (AB010975) Fasciola hepatica France (AJ557567) Fasciola hepatica China (AJ557568) 1696509 NA6 (H6) BD1
Fasciola gigantica China (EU260079) Fasciola gigantica Burkina Faso (AJ853848)
Fasciola cf. hepatica/gigantica Fg-type Korea (HQ821457)*** Fasciola cf. hepatica/gigantica Fh-type Korea (HQ821456)*** Fasciola gigantica VN (EU260061)
1696503 BGS1 (H3) BD1 FspTH.a VN (EU260076)* Fsp1.b Fh-type VN (EU260059)** Fsp2.b Fh-type VN (EU260060)** Fasciola gigantica Indonesia (EU260080) Fasciola gigantica Thailand (AB207149) 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.004 0.000 0.001 0.003 0.000 0.001 0.002 0.000 0.003 0.006 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 0.000 0.002 0.002 0.001 0.000 0.000 0.001 0.004 0.002 0.002
59
Nhận xét: Hình 3.20 cho thấy mẫu BGS1 (H3) có quan hệ gần gũi với F. gigantica của Việt Nam, Thái Lan và Indonesia. Mẫu NA6 (H6) có quan hệ gần gũi với F. gigantica của Trung Quốc, Burkina Faso và mẫu lai của Hàn Quốc. Mẫu THT2 (H5) có quan hệ gần gũi với dạng lai Fasciola của Việt Nam và F. hepatica
của Uruguay.
Nhƣ đã phân tích ở trên, SLGL trong nghiên cứu này có tính đa hình về hình thái. Do đó, nếu chỉ dựa vào các đặc điểm về hình thái khó có thể kết luận SLGL thuộc loại nào, đặc biệt tại các vùng có mặt cả 2 loài gây bệnh cho ngƣời và gia súc [47]. Vì vậy, để kết luận chính xác SLGL trong nghiên cứu này là loài nào chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP theo Mahami Oskouei và CS (2011) [47]: Mẫu sán đƣợc tách chiết ADN tổng số bằng DNeasy kit của hãng QIAGEN (Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất. Ở bƣớc 1 của kỹ thuật PCR-RFLP (thực hiện phản ứng PCR thu nhận gen ITS-2), cặp mồi đƣợc thiết kế theo Mahami Oskouei và CS (2011) [47]. Trình tự mồi 1: 5’ GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA 3’ và mồi ngƣợc; mồi 2 là 5’ TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’ và mồi ngƣợc, có kích thƣớc khoảng 1000 bp. Sau khi thực hiện bƣớc 1 cho kết quả tất cả 314 mẫu (gồm 150 mẫu con SLGL trƣởng thành, 150 mẫu trứng sán trên trâu bò và 14 mẫu trứng sán trên ngƣời) cho sản phẩm ADN với các band có kích thƣớc bằng nhau (1000 bp), đây là kết quả của giống Fasciola. Kết quả này giống kết quả mà Mahami Oskouei và CS (2011) công bố với cặp mồi BD1, BD2 [47].
Ở bƣớc 2: Sử dụng enzyme giới hạn Tsp509I (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP) cắt sản phẩm PCR vừa nhân bản ở bƣớc 1. Trong số 314 mẫu phân tích có 312 mẫu sán và trứng sán là F. gigantica; 01 mẫu trứng sán trên trâu bò tại tỉnh Thanh Hóa là F. hepatica; 01 mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An là mẫu lai F. gigantica/ F. hepatica. Kết quả này cho thấy mẫu sán trên ngƣời là mẫu lai, lý do có thể đây là sự thích nghi của sán trên vật chủ ký sinh là ngƣời. Kết quả này giống với kết quả của Mahami Oskouei và CS (2011) [47], Lê Thanh Hòa (2007) [16], Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) [22], Nguyễn Thu Hƣơng và CS (2012) [20].
60
Tuy nhiên, vì cặp mồi BD1 và BD2 không đặc trƣng cho loài nên kết quả PCR-RFLP chƣa đủ cơ sở để phân biệt SLGL là F. hepatica hay F. gigantica. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn 01 mẫu F. hepatica, 01 mẫu nghi ngờ là dạng lai F. hepatica/F. gigantica và lựa chọn ngẫu nhiên 01 mẫu F. gigantica từ 312 mẫu còn lại để giải trình tự trực tiếp trên máy giải trình tự tự động ABI3130 (USA) với cả mồi xuôi và mồi ngƣợc (BD1 và BD2). Sử dụng kỹ thuật Blast để truy cập và xác định loài bằng cách so sánh với trình tự chuỗi ITS-2 đã đƣợc nhân bản của F. hepatica và F. gigantica đã đƣợc công bố trên Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sau khi giải trình tự chuỗi nucleotide của 3 mẫu đã cho kết quả mẫu BGS1 (H3) có quan hệ gần với F. gigantica thuần của Việt Nam, mẫu NA6 (H6) có xu hƣớng lai giữa F. gigantica và F. hepatica và nghiêng nhiều về nhóm F. gigantica trong cây phân loại, mẫu THT2 (H2) có xu hƣớng lai giữa F. gigantica và F. hepatica và nghiêng nhiều về nhóm F. hepatica trong cây phân loại. So sánh đối chiếu thành phần nucleotide đoạn gen ITS-2 của các mẫu SLGL trong nghiên cứu này với mẫu SLGL Niger cho thấy mức độ tƣơng đồng cao (99%). Mẫu SLGL của Bắc Giang và mẫu trứng SLGL trên trâu bò tại Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 %. Mẫu trứng SLGL trên ngƣời tại Nghệ An có 5 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 99,47 %. Vị trí sai khác đƣợc tìm thấy trên đoạn gen ITS-2 của các mẫu này là vị trí 327.
Nhƣ vậy, với các phân tích trên đây cho thấy trong nghiên cứu này phân loại hình thái và sinh học phân tử của SLGL không đồng nhất. SLGL có tính đa hình về hình thái và nếu chỉ dựa vào hình thái không thì không đủ cơ sở để kết luận SLGL thuộc loài nào. Do vậy, muốn xác định loài SLGL cần dựa vào công cụ sinh học phân tử. Tuy nhiên, phân loại hình thái góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu và định hƣớng lựa chọn hƣớng nghiên cứu phù hợp cho một nghiên cứu chuyên sâu hơn liên quan đến SLGL.
61
KẾT LUẬN
1. Kết quả hình thái học SLGL trƣởng thành trong nghiên cứu này đa số là
Fasciola gigantica. Dựa vào tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán có 90/150 mẫu phù hợp với F. gigantica (chiếm 60%). Theo chỉ số VS-P, có 137/150 mẫu phù hợp với
F. gigantica (chiếm 91,33%). Kết quả phân loại hình thái ở nghiên cứu này cũng chỉ ra loài SLGL trên trâu bò tại 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam là F. gigantica.
2. Kết quả kích thƣớc trứng SLGL trên trâu bò trong nghiên cứu này có 148/150 mẫu là trứng F. gigantica, 2/150 mẫu là trứng F. hepatica. Chiều dài của trứng SLGL dao động từ 150 µm đến 184 µm (trung bình 170,2±7,2 µm), chiều rộng dao động từ 89 µm đến 114 µm (trung bình 100,6±6,1 µm). Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng SLGL dao động từ 1,4 đến 2,06 (trung bình 1,69±0,12).
3. Kết quả phân tích PCR - RFLP 150 mẫu sán lá gan lớn trên trâu bò tại 5 tỉnh nghiên cứu (Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Bắc Giang, Nam Định), có 150 mẫu thuộc loài F. gigantica, không có mẫu nào thuộc loài F. hepatica.
Kết quả chạy PCR - RFLP 150 mẫu trứng sán lá gan lớn trên trâu bò tại 5 tỉnh nghiên cứu có 01 mẫu là F. hepatica, 149 mẫu là F. gigantica.
Kết quả chạy PCR - RFLP 14 mẫu trứng sán lá gan lớn trên ngƣời tại 5 tỉnh nghiên cứu có 13 mẫu là F. gigantica; 01 mẫu là con lai F. hepatica/F. gigantica tại tỉnh Nghệ An.
4. Kết quả giải trình tự chuỗi nucleotide ITS-2 của các mẫu SLGL trong nghiên cứu này có tỷ lệ tƣơng đồng cao so với F. gigantica của Niger. Mẫu SLGL của Bắc Giang và mẫu trứng SLGL trên trâu bò tại Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 %. Mẫu trứng SLGL trên ngƣời tại Nghệ An có 5 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 99,47 %.
Kết quả mối quan hệ loài trên cây phả hệ cho thấy mẫu BGS1 (H3) có quan hệ gần gũi với F. gigantica của Việt Nam, Thái Lan và Indonesia. Mẫu NA6 (H6) có quan hệ gần gũi với F. gigantica của Trung Quốc, Burkina Faso và mẫu lai của Hàn Quốc. Mẫu THT2 (H5) có quan hệ gần gũi với dạng lai Fasciola của Việt Nam và F. hepatica của Uruguay.
62 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KIẾN NGHỊ
Cần có sự phối hợp giữa phƣơng pháp phân loại SLGL về mặt hình thái và phân loại sinh học phân tử để có kết luận chính xác về loài. Tiếp tục nghiên cứu về SLGL trên những chỉ thị di truyền khác (nhƣ COX1, NAD1, ITS-1…) và phân tích những biến đổi ở mức độ phân tử để có những kết luận sâu hơn về tính đa hình di truyền của SLGL ở Việt Nam.
63
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Khắc Lực, Đặng Thị Cẩm Thạch,
Lê Bách Quang (2011), “Xác định loài sán lá gan lớn gây bệnh ở bò khu vực miền Trung và Tây Nguyên (Việt Nam) bằng chỉ thị phân tử gen ty thể COX1”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự, số 2-2011, tr. 96-101.
2. Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Khắc Lực, Nguyễn Thị Vân, Lê
Trần Anh (2011), “Xác định loài và tỉ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở trâu/bò tại huyện Đại Lộc - Quảng Nam”, Công trình khoa học báo cáo tại Hội nghị ký sinh trùng toàn quốc lần thứ 38. Nhà xuất bản Y học-2011, tr. 151-156. 3. Bộ Y tế, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng (2006),
“Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh giun sán ở Việt Nam”, Hà Nội – 2006, tr. 40-48.
4. Nguyễn Văn Chƣơng, Triệu Nguyên Trung, Nguyễn Văn Khá, Bùi Văn Tuấn
(2009), “Nghiên cứu tỉ lệ và một số yếu tố ảnh hƣởng đến nhiễm sán lá gan lớn ở ngƣời tại các tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi và Gia Lai”, Tạp chí Y dược học Quân sự, số chuyên đề 1, tr. 82-87.
5. Nguyễn Quốc Doanh, Lê Thanh Hoà (2006), Một số đặc điểm hình thái và phân tử của sán lá gan (Fasciola spp) ở bò của tỉnh Nghệ An và Cao Bằng.
Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 13(5): 59-67.
6. Nguyễn Văn Đề (2003), “Thông báo ca bệnh sán lá gan lớn ở miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Thông tin Y-Dược, tr. 7-20.
7. Nguyễn Văn Đề (2004), "Tình hình bệnh sán lá gan lớn Fascicoliasis đƣợc phát hiện ở miền Bắc Việt Nam", Tạp chí Y học thực hành, 8, tr. 40-44. 8. Nguyễn Văn Đề (2012), "Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên nhóm bệnh nhân
đƣợc chẩn đoán "u gan" tại bệnh viện Hà Nội năm 2010-2011", Kỷ yếu Hội nghị khoa học quốc tế Mékong Santé III, tr. 22-29.
9. Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa (2008), “Những nghiên cứu sinh học phân tử
trong lĩnh vực ký sinh trùng ở Việt Nam”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV về hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật-2008, tr.456.
64
10.Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, Lê Khánh Thuận (2004), “Xác định loài sán lá gan lớn từ trứng trong phân bệnh nhân bằng phƣơng pháp phân tử hệ gen ty thể”, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 4/2004, tr. 72-79.
11.Nguyễn Văn Đề, Nguyễn Thị Khuê và Lê Thanh Hòa (2011), "Tính lai chéo ngƣợc ở mẫu sán lá gan lớn Fasciola sp thu nhận trên một bệnh nhân tại Nghệ An", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 76(5), tr. 34-40.
12.Võ Thị Hải Lê (2010), “Tình hình nhiễm sán lá gan lớn của trâu, bò tại một số điểm thuộc tỉnh Nghệ An”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XVII, số 5-2010, tr. 30-33.
13.Nguyễn Khắc Lực (2010), “Nghiên cứu một số đặc điểm nhiễm sán lá gan lớn (Fasciola spp.) và hiệu quả một số biện pháp can thiệp tại huyện Đại Lộc – Quảng Nam”, Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Hà Nội.
14.Phạm Văn Lực (2006), “Bệnh sán lá gan trâu bò (Fasciolaliasis) và các yếu tố nguy cơ lây nhiễm sang ngƣời ở tỉnh Đăk Lăk”, Tạp chí y học thực hành, số 9 năm 2006, tr. 41-43.
15.Trần Vinh Hiển, Phan Anh Tuấn, Đặng Tất Thế, Nguyễn Khắc Lực (2008),
“Tỷ lệ nhiễm SLGL Fasciola sp. tại hai xã Chƣ pả và H’ Bông tỉnh Gia Lai”,
Tạp chí Y dược học quân sự, (2), tr. 75-78.
16.Lê Thanh Hòa (2007), “Xác định lai ngoại loài giữa F. hepatica và F. gigantica trong quần thể sán lá gan lớn ở Việt Nam trên cơ sở phân tích sinh học phân tử”, Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, tập 11, phụ bản số 2/2007, tr. 89-97.
17.Lê Thanh Hòa (2007), Chỉ thị di truyền phân tử sử dụng trong giám định, chẩn đoán, phân loại, phả hệ, dịch tễ học và di truyền quần thể ký sinh trùng.
Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 11(PB2):9-14. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
18.Nguyễn Thế Hùng, Lê Thanh Hòa và Giang Hoàng Hà (2008), "Kết quả định loại sán lá gan lớn thu thập ở lò mổ Hà Nội bằn phƣơng pháp PCR", Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XV (số 3), tr. 50-55.
19.Lê Quang Hƣng, Hồ Việt Mỹ, Võ Hƣng, Nguyễn Văn Quốc, Đặng Tất Thế,
Cao Văn Viên, Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung (2003), “Nghiên cứu định loại và đặc điểm dịch tễ học SLGL tại Bình Định”, Báo cáo Hội nghị
65
phòng chống các bệnh sán lá ở người do WHO và FAO tổ chức tại Hà Nội, ngày 26-28/11/2002.
20.Nguyễn Thu Hƣơng (2012), “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học sán lá gan lớn và hiệu quả điều trị của Triclabendazole tại Quảng Ngãi, năm 2009- 2011”, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Viện, Hà Nội 2012.
21.Lê Bách Quang (2008), Ký sinh trùng và côn trùng y học (Giáo trình giảng dạy đại học). Nhà xuất bản Quân đội nhân dân, tr. 233-236.
22.Nguyễn Thị Giang Thanh, Triệu Nguyên Trung và Lê Thanh Hòa (2010), "Nghiên cứu thẩm định loài sán lá gan lớn (Fasciola spp.) gây bệnh trên dê tại Việt Nam bằng chỉ thị phân tử", Tạp chí Công nghệ Sinh học 8 (1), 2010, tr. 21 - 27.
23.Lê Thị Tuyết (2009), “Kết quả xét nghiệm trứng sán lá gan lớn (Fasciola spp.) ở phân ngƣời và trâu/bò tại một số xã huyện Xuân Trƣờng, tỉnh Nam Định”, Tạp chí y học thực hành, 12/2009.
24.Nguyễn Văn Văn (2012), “Nghiên cứu thực trạng sán lá gan lớn ở ngƣời và hiệu quả một số biện pháp can thiệp tại cộng đồng dân cƣ tỉnh Quảng Nam (2009 - 2011)”. Luận án tiến sỹ, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
25.Anderson, N., Luong, T.T., Vo, N.G., Bui, K.L., Smooker, P.M., Spithill, T.W. (1999), “The sensitivity and specifictity of two methods for detecting
Fasciola infection in cattle”. Vet. Parasitol. 83, pp. 15-24.
26.Boore JL (1999), “Animal mitochondrial genomes”. Nucleic Acids Res,
27(8):1767-1178.
27.Boray J.C. (1982), CRC Handbook Series in Zoonoses. Section C: Parasitic Zoonoses, Fascioliasis, pp. 71-88.
28.Brian Kendall S and Parfitt J.W (1953), "Life-history of Fasciola gigantica Cobbold 1856", Nature Journal 171, pp. 1164 - 1165.
29.Dalton J.P. (1999), Fascioliasis, CABI Publishing, Walling ford, UK.
30.Dang TT, Nawa Y (2005), Fasciola and Fascioliasis in Vietnam. Asian Parasitol 1: 57-60.
66
31.Esteban JG, Bargues MD, Mas-Coma S (1998), Geographical distribution, diagnosis and treatment of human fascioliasis a review. Res Rev Parasitol
(58)13-48
32.Farag, H.F (1998), A short note on praziquantel in human fascioliasis, J. Tropical Medicine and Hygein, 89, pp. 79.
33.Fritzscha G., Schjegel M., Stadler PF (2006), Alignments of mitochondrial genome arrangements: applications to metazoan phylogeny. J. Theor Biol. 21;240(4):511-520.
34.Gil G.F., Cervero J.M., Torres P.R., Jussdado Ruiz-Capillas J.J. (2006), “Hepatobiliary fasciolasis without eosinophilia”, Rev Clin Esp; 206 (9), pp. 464.
35.Ghavami MB., Rahimi P., Haniloo A., Mosavinasab SN. (2009), “Genotypic and Phenotypic Analysis of Fasciola Isolates”, Iranian J Parasitol, Vol. 4, No. 3, 2009, pp. 61-70.
36.Guarro J, GenéJ, Stchigel AM. (1999), Review. Developments in fungal taxonomy. Clin Microbiol Rev. 12(3):454-500.
37.Gulsen M.T, M.C., Savas M., Koruk A., Kadayifci F., Demirci. (2006), “Fascioliasis: a report of five cases presenting with common bile duct obstruction”, The Netherlands journal of Medicine, 64 (1), pp. 17-19.
38.Holland, W.G., Luong, T.T., Nguyen, L.A., Do, T.T. (2000), “The epidemiology of nematode and fluke infections in cattle in the Red Rive Delta in Viet Nam”, Veterinary Parasitology, 93, pp. 141-147.
39.Hu M., Gasser RB. (2006), Mitochondrial genomes of parasitic nematodes (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});