Thu thập SLGL trƣởng thành và trứng sán thu đƣợc từ phân ngƣời và dịch mật từ túi mật của buồng gan động vật tại các điểm nghiên cứu. Con sán trƣởng thành và trứng đƣợc ngâm trong nƣớc muối sinh lý (NaCl 0,9%).
Kỹ thuật làm tiêu bản cố định mẫu SLGL trƣởng thành
Thu thập SLGL trƣởng thành và trứng từ bệnh nhân và lò mổ ở các điểm nghiên cứu. Các cá thể sán lá và trứng thu đƣợc sẽ đƣợc rửa chung trong nƣớc muối sinh lí (NaCl 0,9%) 3-4 giờ để đẻ bớt trứng.
Đặt sán lên lam kính sạch cố định bằng cồn 70°, phủ lá kính, cuốn chỉ và định hình trong cồn 70° trong 2 tuần trƣớc khi nhuộm.
Sán lá gan sau khi đƣợc cố định trong cồn 70° và thuốc nhuộm 15 – 30 phút cho đế nkhi có màu mận chín thì bỏ sán vào cồn axit.
Để mẫu SLGL trong cồn axit từ vài giây đến 5 phút cho đến khi sán có màu hồng. Quan sát bằng kính lúp để xác định xem các bộ phận bên trong sán đã rõ thì thôi. Nếu chƣa rõ thì phải để lại vào thuốc nhuộm.
Làm trong: từ cồn axit chuyển sán lần lƣợt sang cồn 80° rồi 90° - 96° từ 10 – 15 phút đối với mỗi loại cồn. Sau đó để giữ sán trong dung dịch xylen.
Gắn gôm, đặt lá kính lên sán (tùy theo độ dày của sán) để gắn chặt sán giữa lam và lá kính.
Sau đó đƣợc định loại bằng dấu hiệu hình thái đến giống hoặc loài theo khóa định loại và mô tả có sẵn của Urquhart (1996) và bảo quản trong cồn ethanol 70% cho tới khi tách chiết ADN tổng số [63].
Dựa vào khóa phân loại, căn cứ vào hình thái và kích thƣớc chiều dài, chiều rộng thân, giác miệng, giác bụng, buồng trứng, tinh hoàn của con SLGL đƣợc xác định thuộc loài F. gigantica (Cobbold, 1885), F. hepatica, giống Fasciola
(Linnaeus, 1785), họ Fasciolidae (Railliet, 1895), bộ Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937).
30
Dựa vào khóa định loại hình thể trứng SLGL theo Skrjabin và CS (1977) và Nguyễn Thị Lê và CS (1996).
Các chỉ số hình thể SLGL trong nghiên cứu này bao gồm: Chiều dài (BL), chiều rộng (BW), kích thƣớc giác bụng (VS), kích thƣớc giác miệng (OS), chiều rộng cổ sán (CW), chiều dài đầu sán (CL), khoảng rộng tinh hoàn (TW), khoảng độ dài tinh hoàn (TL), khoảng cách giác bụng đến cuối thân (VS – P), khoảng cách từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân (Vit – P).
Hình 2.2. Các chỉ số của sán lá gan lớn trƣởng thành [51]
31
Kỹ thuật xét nghiệm phân lắng cặn tìm trứng sán
Phƣơng pháp xét nghiệm phân lắng cặn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc miêu tả bởi Ash và Orihel (1987).