1.8.1. Phƣơng pháp hình thái
Nhiều tác giả cho rằng, hình thể của F. gigantica và F. hepatica có nhiều điểm khác nhau. Điểm khác biệt dễ thấy nhất là F. gigantica có kích thƣớc dài hơn, trong khi F. hepatica có kích thƣớc ngắn hơn. Theo một số tác giả, dựa vào một số chỉ số hình thái có thể xác định và phân biệt các loài SLGL. Các chỉ số cơ thể thƣờng đƣợc sử dụng là chỉ số khối cơ thể (BR), kích thƣớc chiều dài và chiều rộng thân, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng thân sán (BL/BW), giác miệng, giác bụng, buồng trứng, tinh hoàn và khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân (VS-P). Theo một nghiên cứu của Periago và CS (2006), kết quả ở bảng sau [59]:
19
Chỉ số (mm) F. hepatica F. gigantica
BR 1,06 – 1,58 1,71 – 3,65
BL/BW 1,29 – 2,80 3,40 – 6,78
VS-P 8,86 – 25,08 26,28 – 50,09
Tuy nhiên các chỉ số này thay đổi phụ thuộc SLGL vào vật chủ ký sinh nào, khu vực nghiên cứu nào… Một số nghiên cứu cho thấy, các chỉ số BR, BL/BW và VS-P có sự khác biệt căn bản giữa F. hepatica và F. gigantica. Một số khác lại cho thấy các chỉ số này có một phần gối lên nhau. Chính điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc xác định loài sán bằng hình thái học.
1.8.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
1.8.2.1. Đặc điểm, vai trò hệ gen ty thể và hệ gen nhân trong giám định loài
Hiện nay hệ gen ty thể đƣợc sử dụng phổ biến để nghiên cứu về di truyền ở giun sán trong nghiên cứu phả hệ phân tử, xác định hệ thống phân loại và dịch tễ học [16]. Các quần thể giun sán có khả năng đáp ứng với các tác động môi trƣờng và có quá trình chọn lọc tự nhiên, vì vậy không bắt buộc phải đồng nhất về mặt di truyền. Việc sử dụng các phƣơng pháp truyền thống để tìm ra những thay đổi qua đó xác định bằng chứng tiến hóa của một loài nào đó nói chung khó thành công. Sử dụng hệ gen ty thể có ƣu điểm và đƣợc sử dụng nhiều hơn hệ gen nhân trong việc cung cấp những thông tin về bằng chứng tiến hóa của sinh vật [16].
Đặc điểm hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA)
Vùng gen ribosome (rDNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và không mã hóa cho bất kỳ protein nào. Đây là vùng gen bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tƣơng đồng và khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trong trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài và phát hiện hiện tƣợng lai giữa các loài.
Vùng gen rDNA chứa 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA và 3' ETS. Gen ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed spacer 1 and 2) với hai đầu biên là IGS (intergenic spacer là vùng kém
20
bảo tồn nhất của rDNA) (Hình 1.6). Vùng 5,8S – rDNA là vùng có kích thƣớc rất nhỏ và ít có sự biến đổi [62]. Vùng ITS - rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thƣờng để xác định các biệt hóa trong cùng loài để lập phả hệ di truyền [36]. Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao đƣợc sử dụng cho tất các sinh vật cùng loài nhằm khuếch đại các vùng tƣơng đƣơng dùng trong so sánh, tạo phả hệ di truyền. Ngoài ra nhiều primer và probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinh vật [67].
Hình 1.6. Mô hình cấu trúc ribosome ADN của gen nhân [17]
Đặc điểm hệ gen ADN ty thể
ADN ty thể quy định tính di truyền theo dòng mẹ, có kích thƣớc khoảng 16 - 30 kb, bao gồm 36 - 37 gen mã hóa cho sản phẩm protein và một số vùng không mã hóa cần thiết cho sự sao chép và phiên mã [43].
Ngoài các gen mã hóa protein, hệ gen ty thể ký sinh trùng và động vật còn có 2 gen RNA ribosome (rRNA) là 12S rRNA (hay rrnS) và 16S rRNA (hay rrnL), 22 gen RNA vận chuyển (tRNA) và một vùng không gen không mã hóa protein, có độ dài ngắn phụ thuộc vào từng loài động vật [26, 39, 43].
Với vị trí nằm trong tế bào chất, số lƣợng bản sao nhiều của ADN ty thể quy định những đặc điểm di truyền của ty thể [29], đó là: Di truyền theo dòng mẹ; tỷ lệ đột biến cao hơn hệ gen nhân; sao chép độc lập với quá trình phân bào; tác động
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (IGS)
Internal transcribed spacer (ITS)
External transcribed spacer (ETS)
18S 5.8S 18S
ITS-1
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-1 28S 18S 5.8S 2 28S 18S Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-2 -1 28S 28S 5.8S ITS-2 28S ITS-1 18S
Vùng gen cần giải trình tự trong nghiên cứu
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (IGS)
Internal transcribed spacer (ITS)
External transcribed spacer (ETS)
18S 5.8S 18S
ITS-1
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-1 28S 18S 5.8S 2 28S 18S Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-2 -1 28S 28S 5.8S ITS-2 28S ITS-1 18S ITS-1 5.8S ITS-2 28S28S28S 18S ITS-1 5.8S ITS-2 28S28S28S 18S
21
ngƣỡng: để biểu hiện một bệnh cần đòi hỏi ADN bị đột biến phải vƣợt qua một ngƣỡng nào đó; các đột biến ADN ty thể ở tế bào sôma có liên quan đến tuổi tác.
Những ƣu điểm của hệ gen ty thể
Kích thƣớc hệ gen ty thể nhỏ hơn so với hệ gen nhân tế bào, chứa đầy đủ các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên DNA ty thể đƣợc coi là đối tƣợng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen về chẩn đoán, giám định, phân loại, dịch tễ học và di truyền quần thể [43, 26].
Gen ty thể trong cùng loài hoặc có quan hệ dƣới loài sinh học có tính bảo thủ rất cao nên bất kỳ sự thay đổi nhỏ nào cũng là giá trị đƣợc phản ánh trong giám định, phân loại và nghiên cứu di truyền học [33].
Hệ gen ty thể cung cấp nguồn dữ liệu quý giá về chỉ thị phân tử trong nghiên cứu về mối quan hệ giữa các loài và nội bộ loài trong giám định phả hệ và dịch tễ học [71].
Ngoài ra, sự hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể của ký sinh trùng còn có giá trị lớn trong chẩn đoán và phòng chống bệnh nhằm tìm kiếm các loại hóa chất, hóa dƣợc đặc hiệu trong phòng và điều trị bệnh hoặc kiến tạo các loại vaccin thế hệ mới [43, 39]. Đã có nhiều hệ gen ty thể của các loại ký sinh trùng nhƣ giun đũa (Ascaris suum), giun chỉ (Onchocerca), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F. gigantica), sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini)… đƣợc giải mã và phân tích cung cấp nguồn dữ liệu cần thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký sinh trùng [17].
Tính đến năm 1999, chƣa có hệ gen ty thể hoàn chỉnh nào của sán dẹt đƣợc thông báo và đăng ký. Chỉ sau đó chừng 2 năm, một loạt hệ gen ty thể hoàn chỉnh và gần hoàn chỉnh đã đƣợc công bố, trong đó có 6 hệ gen ty thể của sán dẹt (5 của sán dây và 1 của sán lá) [17]. Đến nay, đã có rất nhiều hệ gen ty thể hoàn chỉnh hoặc khá hoàn chỉnh của sán lá, sán dây gây bệnh ở ngƣời và động vật đƣợc công bố nhƣ Paragonimus westermani, Schistosoma mansoni, S japonicum, S. spindale, Taenia crassiceps,T. solium, T. asiatica và T. saginata [17].
Hệ gen ty thể của sán dẹt có cấu trúc và cách sắp xếp tƣơng đối khác so với các động vật đa bào, đặc biệt về chiều dài, thành phần gen, hoặc cấu trúc của ARN vận chuyển và ARN ribosome. Sán dẹt cũng giống giun tròn và một số ít động vật
22
đa bào khác là không có gen atp8. Trong tất cả các hệ gen ty thể của động vật đa bào đƣợc nghiên cứu cho đến nay thì hệ gen ty thể của sán dây (T. crassiceps, T. asiatica, T. solium) là nhỏ nhất (khoảng 13,5-13,7) [17].
Ở động vật nói chung và ở sán dẹt nói riêng, trật tự gen ty thể thƣờng có tính ổn định trong một thời gian dài của quá trình tiến hóa. Sự khác nhau về trật tự gen giữa các thành viên trong cùng một họ rất hiếm, sự khác biệt đáng kể chỉ xảy ra ở mức phân loài lai nhƣ lớp hoặc ngành.
Hệ gen ty thể của động vật có xƣơng sống giàu AT (AT rich) thƣờng chiếm ƣu thế. Đặc điểm này cũng đƣợc ghi nhận ở các gen mã hóa protein ở một số sán dẹt ký sinh. Tuy nhiên, có sự không đồng nhất giữa các loài. Ví dụ, ở sán dây T. crassiceps và tất cả các loài sán máng khác tỷ lệ AT trên 70% (ngoại trừ S. mansoni 68,7%). Ở sán lá gan lớn F. hepatica là 63,5% và ở sán lá phổi P. westermani chỉ có 51,5% [17].
Các ARN vận chuyển ở sán dẹt nhìn chung giống với các động vật không xƣơng sống khác (ngoại trừ giun tròn Nematoda).
Đối với lớp sán lá (Trematoda) hệ gen ty thể đƣợc xác nhận là chỉ thị phân tử thiết yếu trong công tác giám định, thẩm định loài [16]. Trên thực tế, các gen
NAD1, COX1, COB thƣờng đƣợc sử dụng để giám định và định loại các loài có họ hàng gần gũi; các gen NAD3,16S, 12S, vùng không mã hóa thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại và so sánh biến đổi gen của các loài có họ hàng xa.
Bên cạnh đó, các gen thuộc hệ gen nhân nhƣ các gen ribosome (18S, 28S, 58S) và vùng giao gen (ITS-1, ITS-2) thƣờng đƣợc dùng trong phân tích phân loại. Đáng lƣu ý là ITS-1 và ITS-2 có mức độ biến đổi ngoại loài rất cao, khó có thể sử dụng để so sánh phân tích các loài khác giống, nhƣng chúng lại là đối tƣợng lý tƣởng trong nghiên cứu phả hệ nguồn gốc các chủng trong cùng loài hoặc cùng giống, nhất là hiện tƣợng nội bộ loài hay khác loài [16].
Sự khác nhau giữa số lƣợng của các cặp nucleotide của gen ITS-2 là một đặc điểm để phân biệt giữa 2 loài F. hepatica và F. gigantica: Sự thiếu hụt 1 nucleotide ở vị trí số 327 của vùng ITS-2 (Thymin, T) làm cho tổng số nucleotide của ITS-2 còn 361, cho phép xác định vùng ITS-2 đó sẽ thuộc về nhóm F. gigantica và số nucleotide là 362 thì gen ITS-2 thuộc nhóm F. hepatica [44, 58]. Hiện tƣợng “lai
23
chéo ngƣợc” của SLGL ký sinh trên ngƣời tại Việt Nam đã đƣợc khẳng định thông qua thực hiện phân tích gen nhân ITS-2 và gen ty thể COX1 từ mẫu SLGL trƣởng thành thu trên bệnh nhân ngƣời Nghệ An [11].
Các gen ty thể là cấu trúc di truyền theo dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài có khả năng lai hay trong vùng tạp lai ngoại loài, nhất thiết cần xem xét thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2), vì gen nhân còn di truyền theo dòng bố. Từ đó, việc phân tích dòng lai sẽ xác định đƣợc di truyền theo bố hay mẹ [16].
1.8.2.2.Các kỹ thuật sử dụng trong xác định và phân biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica
Sự ra đời của sinh học phân tử giúp các nhà khoa học có thêm nhiều công cụ để xác định một loài sinh vật hay phân biệt các loài sinh vật với nhau.
Tại Việt Nam, nghiên cứu SLGL dƣới góc độ phân tử đã đƣợc một số tác giả thực hiện từ năm 2002. Bƣớc đầu, các nghiên cứu này đã giúp xác định loài SLGL gây bệnh ở nhiều điểm khác nhau trong cả nƣớc. Các công trình nghiên cứu sau này bằng sinh học phân tử đã khẳng định loài F. gigantica gây bệnh chủ yếu cho gia súc ở Việt Nam [2, 22]. Một số nghiên cứu khác sử dụng hệ gen nhân và hệ gen ty thể đã cho kết luận SLGL gây bệnh trên ngƣời và trên động vật ở Việt Nam là F. gigantica có dạng lai với F. hepatica [22]. Các nghiên cứu trong nƣớc chủ yếu sử dụng các gen NAD1 [10], COX1 [1, 22] thuộc hệ gen ty thể và vùng ITS-2 thuộc hệ gen nhân trong giám định thành phần loài [22]. Đối với Fasciola spp., nhiều công cụ khác nhau đã đƣợc thiết kế để xác định và phân biệt giữa F. hepatica và F. gigantica nhƣ: PCR cơ bản kết hợp với giải trình tự, multiplex PCR, SSCP-PCR, LAMP, RFLP-PCR… Trong đó, PCR kết hợp với giải trình tự và RFLP-PCR là các công cụ thƣờng đƣợc lựa chọn hơn cả [20].
1.9. Thuốc điều trị sán lá gan lớn tại Việt Nam
Điều trị bệnh SLGL chủ yếu là điều trị nội khoa và cần điều trị sớm có thể khỏi hoàn toàn. Một số thuốc sử dụng để điều trị gồm:
Tricalabendazole: Là thuốc đặc hiệu trong điều trị SLGL ở ngƣời hiện nay. Liều duy nhất 10 – 12mg/kg trọng lƣợng cơ thể kể cả giai đoạn cấp và mãn tính ở ngƣời. So với các thuốc diệt sán khác thì thuốc này có tác động trên cả thể trƣởng
24
thành và chƣa trƣởng thành. Thuốc cũng dùng để điều trị thể cấp tính và mãn tính bệnh sán lá ở cừu, bò và gia súc nhƣ SLGL (F. hepatica, F. gigantica) và sán lá phổi (Paragonimus westermani, Paragonimus khác).
Emetine hay dehydroemetine: Thuốc có tác dụng tốt nhƣng thuốc này có nhiều tác dụng phụ nhất là cho ngƣời già, lại điều trị kéo dài. Liều lƣợng: 1mg/kg cơ thể, dùng trong 10 ngày. Do độc tính của thuốc nên hiện không sử dụng cho ngƣời.
Bithionol: Thuốc có tác dụng diệt sán thấp, chỉ đạt 50%, liều lƣợng: 30 – 50mg/kg cơ thể, dùng cách nhật, trong 10 – 15 ngày, hoặc 30mg/kg cơ thể trong 5 ngày liền. Hiện thuốc này cũng không sử dụng cho ngƣời.
Artesunat: Tại Việt Nam thuốc đã đƣợc ứng dụng điều trị với liều Artersunate viên 4mg/kg cơ thể trong 10 – 14 ngày liên tục, theo đƣờng uống, cho thấy có hiệu quả cao gần tƣơng đƣơng với thuốc Triclabendazole [48], nhƣng chƣa đƣợc áp dụng rộng rãi trên lâm sàng, cần phải nghiên cứu thêm.
25
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu trứng và sán lá gan lớn trƣởng thành thu thập từ ngƣời và động vật tại các điểm nghiên cứu.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm khoa Ký sinh trùng và khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng
Mẫu thu trên ngƣời và động vật tại Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Nam Định.
Thời gian nghiên cứu: Năm 2013 - 2014.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị chung
Kính hiển vi Nikon E100 (Trung Quốc)
26
Máy ly tâm Eppendorf Z233M2 (tốc độ 15000 vòng/phút)
Máy PCR Eppendorf Mastercycler
27 Máy ổn nhiệt (Tempette Junior Techne)
Máy Vortex (Gyromax 737R Ameres Instrument) Cân điện tử (Shinko DJ 2 kg/0,01 g, Nhật)
Tủ lạnh - 20°C, - 80°C (Sanyo) Lò vi sóng (Sanyo)
Bộ điện di kiểm tra sản phẩm PCR (Bio – Rad) Bộ pipetman (Gilson)
Eppendorf 1,5 ml
2.3. Hóa chất
Hóa chất dùng nhuộm tiêu bản
Hóa chất dùng để tách chiết ADN của hãng QIAgen, Mỹ Bộ kít tách mô: DNeasy Tissue Kit hãng QIAgen, Mỹ Ethanol 70% - 90% lạnh
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
Taq-Polymerase (50 U/µl, Eurogentec, Searing, Belgium), Primer (hãng Takaza, Nhật Bản); 10x PCR buffer.
Sử dụng cặp mồi BD1 và BD2 (theo Mahami Oskouei và CS, 2011) để khuếch đại đoạn gen chứa ITS-2
Mồi BD1: 5’ GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA 3’ Mồi BD2: 5’ TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT 3’ Dung dịch nhuộm ADN: Ethidium bromide 10mg/ml Dung dịch TBE 10X Dung dịch TBE 0,5X Bột gel agarose Nƣớc cất 2 lần, nƣớc khử ion Ethanol 70° Cồn tuyệt đối Nitro lỏng
Ngoài ra còn sử dụng một số trang thiết bị, dụng cụ khác nhƣ buồng mix PCR, chày, cối chuyên dụng (dùng để nghiền sán), panh, giấy parafin…
28
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.4.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu SLGL trƣởng thành thu thập từ ngƣời và động vật Làm tiêu bản Chụp ảnh, đo đạc các chỉ số Tách ADN tổng số Nhận xét hình thể; so sánh