3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen ITS-2 bằng kỹ thuật PCR
Chúng tôi tiến hành phân tích 150 mẫu con sán lá gan lớn, 150 mẫu trứng sán ở trâu bò tại 5 tỉnh (Bắc Giang, Hà Nội, Nam Định, Nghệ An, Thanh Hóa) và 14 mẫu trứng sán thu từ phân ngƣời. Sau khi tiến hành nhân bản gen bằng phản ứng PCR thu đƣợc 314 mẫu (bao gồm 150 mẫu con sán trƣởng thành và 164 mẫu trứng sán) cho sản phẩm ADN với các băng có kích thƣớc bằng nhau 1.000 bp, đây là kết quả của giống Fasciola spp.
45
Hình 3.8. Kết quả nhân gen mẫu SLGL bằng phản ứng PCR
3.2.2. Kết quả PCR - RFLP
Tiến hành phản ứng PCR-RFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn Tsp509I đối với các sản phẩm của phản ứng PCR, vì Tsp509I có thể tách riêng các loài Fasciola spp.. Enzyme này nhận biết chuỗi AATT trong ADN sợi đôi và cắt sau vị trí 0 trên mỗi mạch [47].
46
Kết quả ở hình 3.8 cho thấy trong số 150 mẫu con sán lá gan lớn trƣởng thành, chúng tôi thu đƣợc 150 mẫu bị cắt cho kết quả 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 213, 343 bp; không có mẫu nào bị cắt cho kết quả 4 băng ở các vị trí 102, 171, 343, 427 bp.
Hình 3.10. Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng BGS1
Hình 3.9 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 290 đến 340) của mẫu BGS1 có tín hiệu rõ nét.
47
Kết quả ở hình 3.10 cho thấy mẫu THT2 bị cắt cho kết quả 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 343, 427 bp.
Hình 3.12. Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng THT2
Hình 3.11 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 220 đến 270) của mẫu THT2 có tín hiệu rõ nét.
Trong số 150 mẫu trứng sán thu từ dịch mật của buồng gan trâu bò có 01 mẫu thu tại Thanh Hóa khi cắt bằng enzyme Tsp509I cho kết quả 4 băng tƣơng ứng là: 102, 171, 343, 427 bp và 149 mẫu còn lại bị cắt cho 5 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 208, 219, 343 bp; không có mẫu nào bị cắt cho 5 băng tại các vị trí 102, 171, 213, 343 và 427 bp. Kết quả trên cho thấy mẫu trứng sán lá gan lớn thu tại Thanh Hóa là F. hepatica, 149 mẫu còn lại là F. gigantica. Nhƣ vậy, đa số trâu bò tại 5 tỉnh miền Bắc nhiễm F. gigantica, một số ít trƣờng hợp nhiễm F. hepatica. Kết quả này trùng với kết quả của Lê Thanh Hòa (2007) [16], Nguyễn Thị Giang Thanh (2010) [22].
48
Hình 3.13. Sản phẩm PCR-RFLP của các mẫu sán cho kết quả F. gigantica/F. hepatica (mẫu NA6)
Trong số 14 mẫu trứng sán trên ngƣời có 13 mẫu bị cắt cho 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là: 102, 171, 213 và 343 bp và 01 mẫu bệnh nhân tại Nghệ An (mẫu NA6) sau khi bị cắt cho ra 5 băng tại các vị trí 102, 171, 213, 343 và 427 bp.
49
Hình 3.13 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 290 đến 340) của mẫu NA6 có tín hiệu rõ nét.
Trong số 314 mẫu phân tích có 312 mẫu sán và trứng sán là F. gigantica; 01 mẫu trứng sán trên trâu bò tại tỉnh Thanh Hóa là F. hepatica; 01 mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An là F. gigantica/ F. hepatica. Kết quả này cho thấy mẫu sán trên ngƣời có dạng lai F. gigantica và F. hepatica, lý do có thể đây là sự thích nghi của sán trên vật chủ ký sinh là ngƣời. Kết quả này giống với kết quả của Mahami Oskouei và CS (2011) [47], Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) [22], Nguyễn Thu Hƣơng và CS (2012) [20].
Trong kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) cho thấy điểm khác biệt trong việc sử dụng chỉ thị gen di truyền. Khi sử dụng chỉ thị gen
COX 1 (thuộc hệ gen ty thể), các gen không biến đổi và di truyền theo dòng mẹ là
F. gigantica, trong khi đó nếu sử dụng chỉ thị ITS-2 (thuộc hệ gen nhân) đã xác định đƣợc loài mới là dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica [22]. Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi đã đóng góp thêm bằng chứng về dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica trên vật chủ là ngƣời (tại tỉnh Nghệ An).
3.2.3. Kết quả so sánh sự sai khác, tỷ lệ tƣơng đồng của trình tự ITS-2
Chúng tôi tiến hành giải trình tự 01 mẫu sán trƣởng thành tại Bắc Giang (BGS1), 01 mẫu trứng trên trâu bò tại Thanh Hóa (THT2), 01 mẫu trứng trên ngƣời tại Nghệ An (NA6). Sau đó kết quả giải trình tự đƣợc Blast trên GENBANK để so sánh độ tƣơng đồng. Kết quả nhƣ sau:
50
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F. hepatica của Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK
51
Hình 3.15 cho thấy trình tự ITS-2 của mẫu trứng Thanh Hóa (THT2) sai khác 2 nucleotide so với mẫu F. hepatica của Niger (AM900370.1), độ tƣơng đồng 99 %.
Hình 3.16. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F. gigantica của Niger (JN828955.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
52
Hình 3.16 cho thấy trình tự ITS-2 của mẫu trứng Thanh Hóa (THT2) sai khác 13 nucleotide so với mẫu F. gigantica của Niger (JN628955.1), độ tƣơng đồng 99 %.
Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F. gigantica của Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK
53
Hình 3.17 cho thấy trình tự ITS-2 của mẫu sán Bắc Giang (BGS1) sai khác 5 nucleotide so với mẫu F. gigantica của Niger (AM900370.1), độ tƣơng đồng 99 %.
Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F. hepatica của Tây Ban Nha (AM709649.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK
54
Trình tự ITS-2 của mẫu sán Bắc Giang (BGS1) sai khác 14 nucleotide so với mẫu F. hepatica của Tây Ban Nha (AM709649.1), độ tƣơng đồng 99 % (Hình 3.18).
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu NA6 (H6) với trình tự mẫu F. hepatica của Tây Ban Nha (AM709499.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK
55
Trình tự ITS-2 của mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An (NA6) sai khác 14 nucleotide so với mẫu F. hepatica của Tây Ban Nha (AM709499.1), độ tƣơng đồng 99 % (Hình 3.19).
Hình 3.20. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu NA6 với trình tự mẫu F. gigantica của Niger (AM850108.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK
56
Trình tự ITS-2 của mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An (NA6) sai khác 5 nucleotide so với mẫu F. gigantica của Niger (AM850108.1), độ tƣơng đồng 99 % (Hình 3.20).
Nhƣ vậy, chúng tôi nhận thấy sau khi chạy Blast trên GENBANK, kết quả cho thấy mẫu trứng SLGL trên trâu bò tại Thanh Hóa (mẫu THT2) trong nghiên cứu này có mối quan hệ gần gũi với cả F. hepatica và F. gigantica của Niger (độ tƣơng đồng 99 %) (Hình 3.15 và hình 3.16); mẫu SLGL tại Bắc Giang (mẫu BGS1) trong nghiên cứu này có quan hệ gần gũi với SLGL F. gigantica của Niger và F. hepatica
của Tây Ban Nha (độ tƣơng đồng 99 %) (Hình 3.17 và hình 3.18); mẫu trứng SLGL trên bệnh nhân tại Nghệ An (mẫu NA6) có quan hệ gần với SLGL F. gigantica của Niger và F. hepatica của Tây Ban Nha (độ tƣơng đồng 99%) (Hình 3.19 và hình 3.20).
Bảng 3.10. Vị trí biến đổi của nucleotide của vùng gen ITS-2 của mẫu sán [11]
Mẫu Vị trí nucleotide số 327 Tổng số cặp
nucleotide Định loại sán
Australia (EU260058) T 362 F. hepatica
THT2 T 362 F. hepatica
BGS1 - 361 F. gigantica
NA6 - 361 F. gigantica
Indonesia (EU260080) - 361 F. gigantica
Sản phẩm PCR-RFLP sau khi giải trình tự đƣợc so sánh với ITS-2 của các mẫu ở Indonesia (đặc trƣng cho loài F. gigantica thuần) và mẫu ở Australia (đặc trƣng cho loài F. hepatica thuần) [11, 44]. Kết quả cho thấy tại vị trí 327, mẫu THT2 có chứa nucleotide T, mẫu BGS1 và mẫu NA6 không có nucleotide T (Bảng 3.10). Nhƣ vậy, mẫu trứng trên trâu bò tại Thanh Hóa giống với F. hepatica, mẫu sán trƣởng thành tại Bắc Giang và mẫu trứng trên ngƣời tại Nghệ An giống với F. gigantica. Kết quả này trùng với kết quả của Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) [22], Nguyễn Văn Đề (2011) [11], Lê Thanh Hòa và CS (2008) [44].
57
Bảng 3.11. Sự sai khác và mức độ tƣơng đồng về nucleotide của các mẫu SLGL tại điểm nghiên cứu với F. gigantica của Niger
Ký hiệu Nơi phân lập Số nucleotide sai
khác (nu) Tỷ lệ tƣơng đồng (%) F.g_NG Niger 0 100 Fas.BG Bắc Giang 13 98,59 Fas.NA Nghệ An 5 99,47
Fas.TH Thanh Hóa 13 98,59 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.11 cho thấy trình tự chuỗi nucleotide gen ITS-2 của các mẫu SLGL trong nghiên cứu này có tỷ lệ tƣơng đồng cao so với F. gigantica của Niger. Mẫu SLGL của Bắc Giang và mẫu trứng SLGL trên trâu bò tại Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 %. Mẫu trứng SLGL trên ngƣời tại Nghệ An có 5 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 99,47 %.
58
3.2.4. Kết quả mối tƣơng quan trên cây phả hệ
Hình 3.21. Sơ đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ phả hệ dựa trên trình tự đoạn gen thu đƣợc của SLGL trong nghiên cứu với SLGL ở một số nƣớc trong khu vực và
trên thế giới
(*Kết quả đã công bố mẫu dạng lai theo Le et al, 2008 [44]; **Kết quả đã công bố mẫu có chứa trình tự ITS – 2 của cả 2 loài F. gigantica và F. hepatica theo Le et al, 2008 [44];
***Kết quả đã công bố mẫu con lai theo Se – Eun Choe, 2011 [61])
Fasciola sp. Japan (AB207150) Fasciola hepatica Korea (HQ821448) Fasciola hepatica Ireland (AB207148) Fasciola hepatica Spain (AJ272053) Fasciola hepatica Australia (EU260058) FspN.a VN (EU260073)* FspCB2.a VN (EU260065)* FspBD1.a VN (EU260062)* FspNA.a VN (EU260071)* FspFG2.a VN (EU260067)* FspFG1.a VN (EU260066)* FspCB1.a VN (EU260064)* FspH1.a VN (EU260068)*
Fasciola hepatica Uruguay (AB010974) FspH2.a VN (EU260069)*
1696507 THT2 (H5) BD1
Fasciola gigantica Zambia (AB010975) Fasciola hepatica France (AJ557567) Fasciola hepatica China (AJ557568) 1696509 NA6 (H6) BD1
Fasciola gigantica China (EU260079) Fasciola gigantica Burkina Faso (AJ853848)
Fasciola cf. hepatica/gigantica Fg-type Korea (HQ821457)*** Fasciola cf. hepatica/gigantica Fh-type Korea (HQ821456)*** Fasciola gigantica VN (EU260061)
1696503 BGS1 (H3) BD1 FspTH.a VN (EU260076)* Fsp1.b Fh-type VN (EU260059)** Fsp2.b Fh-type VN (EU260060)** Fasciola gigantica Indonesia (EU260080) Fasciola gigantica Thailand (AB207149) 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.004 0.000 0.001 0.003 0.000 0.001 0.002 0.000 0.003 0.006 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 0.000 0.002 0.002 0.001 0.000 0.000 0.001 0.004 0.002 0.002
59
Nhận xét: Hình 3.20 cho thấy mẫu BGS1 (H3) có quan hệ gần gũi với F. gigantica của Việt Nam, Thái Lan và Indonesia. Mẫu NA6 (H6) có quan hệ gần gũi với F. gigantica của Trung Quốc, Burkina Faso và mẫu lai của Hàn Quốc. Mẫu THT2 (H5) có quan hệ gần gũi với dạng lai Fasciola của Việt Nam và F. hepatica
của Uruguay.
Nhƣ đã phân tích ở trên, SLGL trong nghiên cứu này có tính đa hình về hình thái. Do đó, nếu chỉ dựa vào các đặc điểm về hình thái khó có thể kết luận SLGL thuộc loại nào, đặc biệt tại các vùng có mặt cả 2 loài gây bệnh cho ngƣời và gia súc [47]. Vì vậy, để kết luận chính xác SLGL trong nghiên cứu này là loài nào chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP theo Mahami Oskouei và CS (2011) [47]: Mẫu sán đƣợc tách chiết ADN tổng số bằng DNeasy kit của hãng QIAGEN (Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất. Ở bƣớc 1 của kỹ thuật PCR-RFLP (thực hiện phản ứng PCR thu nhận gen ITS-2), cặp mồi đƣợc thiết kế theo Mahami Oskouei và CS (2011) [47]. Trình tự mồi 1: 5’ GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA 3’ và mồi ngƣợc; mồi 2 là 5’ TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’ và mồi ngƣợc, có kích thƣớc khoảng 1000 bp. Sau khi thực hiện bƣớc 1 cho kết quả tất cả 314 mẫu (gồm 150 mẫu con SLGL trƣởng thành, 150 mẫu trứng sán trên trâu bò và 14 mẫu trứng sán trên ngƣời) cho sản phẩm ADN với các band có kích thƣớc bằng nhau (1000 bp), đây là kết quả của giống Fasciola. Kết quả này giống kết quả mà Mahami Oskouei và CS (2011) công bố với cặp mồi BD1, BD2 [47].
Ở bƣớc 2: Sử dụng enzyme giới hạn Tsp509I (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP) cắt sản phẩm PCR vừa nhân bản ở bƣớc 1. Trong số 314 mẫu phân tích có 312 mẫu sán và trứng sán là F. gigantica; 01 mẫu trứng sán trên trâu bò tại tỉnh Thanh Hóa là F. hepatica; 01 mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An là mẫu lai F. gigantica/ F. hepatica. Kết quả này cho thấy mẫu sán trên ngƣời là mẫu lai, lý do có thể đây là sự thích nghi của sán trên vật chủ ký sinh là ngƣời. Kết quả này giống với kết quả của Mahami Oskouei và CS (2011) [47], Lê Thanh Hòa (2007) [16], Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) [22], Nguyễn Thu Hƣơng và CS (2012) [20].
60
Tuy nhiên, vì cặp mồi BD1 và BD2 không đặc trƣng cho loài nên kết quả PCR-RFLP chƣa đủ cơ sở để phân biệt SLGL là F. hepatica hay F. gigantica. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn 01 mẫu F. hepatica, 01 mẫu nghi ngờ là dạng lai F. hepatica/F. gigantica và lựa chọn ngẫu nhiên 01 mẫu F. gigantica từ 312 mẫu còn lại để giải trình tự trực tiếp trên máy giải trình tự tự động ABI3130 (USA) với cả mồi xuôi và mồi ngƣợc (BD1 và BD2). Sử dụng kỹ thuật Blast để truy cập và xác định loài bằng cách so sánh với trình tự chuỗi ITS-2 đã đƣợc nhân bản của F. hepatica và F. gigantica đã đƣợc công bố trên Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sau khi giải trình tự chuỗi nucleotide của 3 mẫu đã cho kết quả mẫu BGS1 (H3) có quan hệ gần với F. gigantica thuần của Việt Nam, mẫu NA6 (H6) có xu hƣớng lai giữa F. gigantica và F. hepatica và nghiêng nhiều về nhóm F. gigantica trong cây phân loại, mẫu THT2 (H2) có xu hƣớng lai giữa F. gigantica và F. hepatica và nghiêng nhiều về nhóm F. hepatica trong cây phân loại. So sánh đối chiếu thành phần nucleotide đoạn gen ITS-2 của các mẫu SLGL trong nghiên cứu này với mẫu SLGL Niger cho thấy mức độ tƣơng đồng cao (99%). Mẫu SLGL của Bắc Giang và mẫu trứng SLGL trên trâu bò tại Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 %. Mẫu trứng SLGL trên ngƣời tại Nghệ An có 5 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 99,47 %. Vị trí sai khác đƣợc tìm thấy trên đoạn gen ITS-2 của các mẫu này là vị trí 327.
Nhƣ vậy, với các phân tích trên đây cho thấy trong nghiên cứu này phân loại hình thái và sinh học phân tử của SLGL không đồng nhất. SLGL có tính đa hình về hình thái và nếu chỉ dựa vào hình thái không thì không đủ cơ sở để kết luận SLGL thuộc loài nào. Do vậy, muốn xác định loài SLGL cần dựa vào công cụ sinh học phân tử. Tuy nhiên, phân loại hình thái góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu và định hƣớng lựa chọn hƣớng nghiên cứu phù hợp cho một nghiên cứu chuyên sâu hơn liên quan đến SLGL.
61
KẾT LUẬN
1. Kết quả hình thái học SLGL trƣởng thành trong nghiên cứu này đa số là
Fasciola gigantica. Dựa vào tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán có 90/150 mẫu phù hợp với F. gigantica (chiếm 60%). Theo chỉ số VS-P, có 137/150 mẫu phù hợp với
F. gigantica (chiếm 91,33%). Kết quả phân loại hình thái ở nghiên cứu này cũng chỉ ra loài SLGL trên trâu bò tại 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam là F. gigantica.
2. Kết quả kích thƣớc trứng SLGL trên trâu bò trong nghiên cứu này có 148/150 mẫu là trứng F. gigantica, 2/150 mẫu là trứng F. hepatica. Chiều dài của trứng SLGL dao động từ 150 µm đến 184 µm (trung bình 170,2±7,2 µm), chiều rộng dao động từ 89 µm đến 114 µm (trung bình 100,6±6,1 µm). Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng SLGL dao động từ 1,4 đến 2,06 (trung bình 1,69±0,12).
3. Kết quả phân tích PCR - RFLP 150 mẫu sán lá gan lớn trên trâu bò tại 5 tỉnh nghiên cứu (Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Bắc Giang, Nam Định), có 150 mẫu thuộc loài F. gigantica, không có mẫu nào thuộc loài F. hepatica.
Kết quả chạy PCR - RFLP 150 mẫu trứng sán lá gan lớn trên trâu bò tại 5 tỉnh nghiên cứu có 01 mẫu là F. hepatica, 149 mẫu là F. gigantica. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả chạy PCR - RFLP 14 mẫu trứng sán lá gan lớn trên ngƣời tại 5 tỉnh nghiên cứu có 13 mẫu là F. gigantica; 01 mẫu là con lai F. hepatica/F. gigantica tại tỉnh Nghệ An.
4. Kết quả giải trình tự chuỗi nucleotide ITS-2 của các mẫu SLGL trong nghiên cứu này có tỷ lệ tƣơng đồng cao so với F. gigantica của Niger. Mẫu SLGL của Bắc Giang và mẫu trứng SLGL trên trâu bò tại Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 %. Mẫu trứng SLGL trên ngƣời tại Nghệ An