34
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả về hình thái của sán lá gan lớn tại các địa điểm nghiên cứu
Để phân biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica, các tác giả trƣớc đây thƣờng dựa chủ yếu vào các đặc điểm: Kích thƣớc của F. gigantica dài hơn, phần nhô lên của vai và phần đầu hình nón ngắn hơn, buồng trứng chia nhiều nhánh hơn, kích thƣớc giác bụng lớn hơn giác miệng…[40]. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng các chỉ số trên có khoảng gối lên nhau về mặt số lƣợng và kích thƣớc, do vậy trong nhiều trƣờng hợp khó phân biệt F. hepatica và F. gigantica. Thời gian gần đây một số nghiên cứu chỉ ra rằng các chỉ số BR (chu vi cơ thể), tỷ số BL/BW, VS-P có sự khác biệt rõ ràng, ít có khoảng gối lên nhau; nên đây đƣợc coi là các chỉ số hình thái có giá trị trong việc phân biệt F. hepatica và F. gigantica [59, 60].
Trong nghiên cứu này, để thu đƣợc các chỉ số hình thái của SLGL, chúng tôi áp dụng cách xác định các chỉ số của Urquhart và cộng sự (2006) [64]. Chúng tôi đã tiến hành đo đạc kích thƣớc 11 chỉ số hình thái của 150 mẫu SLGL thu thập đƣợc từ 5 tỉnh khu vực miền Bắc – Việt Nam (Hà Nội 30 mẫu, Nam Định 30 mẫu, Bắc Giang 30 mẫu, Nghệ An 30 mẫu, Thanh Hóa 30 mẫu). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
3.1.1. Kích thƣớc sán lá gan lớn ở động vật
Bảng 3.1. Kích thƣớc chiều dài và chiều rộng của sán lá gan lớn
Tỉnh n
BL (mm) BW (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 28 39 33,3±3,43 7,5 12 9,38±1,28 Hà Nội 30 29 42,3 35,15±3,85 8 14 10,18±1,36 Nam Định 30 27,6 41 34,42±3,26 7,7 13 10,24±1,24 Nghệ An 30 27 42 34,57±3,63 8 11 9,72±0,76 Thanh Hóa 30 27 41 35,0±3,59 8 11,2 9.86±0,82 Tổng 150 27 42,3 34,49±3,57 7,5 14 9,88±1,15
35
Kết quả đo kích thƣớc hình thái học của 150 mẫu SLGL đã đƣợc nhuộm Carmin (Bảng 3.1) cho thấy: hầu hết các mẫu sán có dạng thon dài, chiều dài của SLGL dao động từ 27 mm đến 42,3 mm (trung bình 34,49±3,57 mm), chiều rộng dao động từ 7,5 mm đến 14 mm (trung bình 9,88±1,15 mm).
Bảng 3.2. Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của sán lá gan lớn
Tỉnh n BL/BW Min Max TB Bắc Giang 30 2,33 4,67 3,6±0,52 Hà Nội 30 2,52 4,94 3,5±0,54 Nam Định 30 2,41 4,75 3,41±0,52 Nghệ An 30 2,5 4,33 3,57±0,43 Thanh Hóa 30 2,59 4,22 3,57±0,41 Tổng 150 2,33 4,94 3,43±0,49
Bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ BL/BW của SLGL dao động từ 2,33 đến 4,94 (trung bình 3,43±0,49).
Hình 3.1. So sánh tỷ lệ BL/BW của sán lá gan lớn tại 5 tỉnh miền Bắc 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 Bắc Giang Hà Nội Nam Định Nghệ An Thanh Hóa 2.33 2.52 2.41 2.5 2.59 4.67 4.94 4.75 4.33 4.22 Min Max
36
So với SLGL ở các nghiên cứu khác trong nƣớc và các nghiên cứu trên thế giới (Phụ lục 1), kích thƣớc chiều dài và chiều rộng của SLGL trong nghiên cứu này ở mức trung bình. Nghiên cứu của Nguyễn Quốc Doanh và CS (2006) tại Nghệ An và Cao Bằng cho kết quả kích thƣớc F. gigantica có chiều dài dao động từ 37,76 – 52,75 mm, chiều rộng dao động từ 10,49 – 14,46 mm (trung bình 12,45±1,01 mm); còn F. hepatica có chiều dài dao động từ 20,56 – 47,59 mm, chiều rộng dao động từ 8,79 – 15,52 mm (trung bình 11,74±1,43 mm) [5]. Theo Periago và CS (2008) nghiên cứu tại Hy Lạp cho kết quả chiều dài của F. hepatica là 15,48-28,71 mm (trung bình 23,73±0,33 mm), của Fasciola sp. là 23,46 – 45,4 mm (trung bình 33,88±0,34 mm), của F. gigantica là 35,25 – 48,71 mm (trung bình 44,65±1,15 mm) [60]. Nhƣ vậy, kích thƣớc SLGL trong nghiên cứu này có kích thƣớc trung bình so với một số nghiên cứu khác tại Việt Nam, Hy Lạp, Iran, Ai Cập. Sự khác biệt về kích thƣớc SLGL có thể do sự khác nhau của vật chủ mà sán ký sinh, mật độ sán nhiễm trong vật chủ…
Bảng 3.3. Chu vi giác bụng và giác miệng
Tỉnh n
Chu vi giác bụng VS (µm) Chu vi giác miệng OS (µm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 358,02 339,35 352,06±48,48 216,82 233,12 250,37±48,77 Hà Nội 30 236,86 439,78 385,9±36,13 182,12 336,7 248,43±43,05 Nam Định 30 327,103 459,51 404,03±34,79 164,3 325,99 259,88±40,02 Nghệ An 30 311,64 471,38 398,11±46,97 197,84 326,8 264,92±38,75 Thanh Hóa 30 317,9 458,61 400,34±44,32 201,84 358,18 281,57±41,76 Tổng 150 236,86 471,38 388,09±46,07 164,3 358,18 261,03±43,7
Chu vi giác miệng và giác bụng đƣợc tính theo công thức chu vi hình elip. Kết quả bảng 3.3 cho thấy chu vi trung bình của giác bụng lớn hơn của giác miệng. Cụ thể, chu vi trung bình của giác bụng là 388,09±46,07µm (dao dộng từ 236,86 µm đến 471,38 µm) và của giác miệng là 261,03±43,7 µm (dao dộng từ 164,3 µm đến 358,18 µm). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê khi sử dụng kiểm định ghép cặp (pair T-test), với CI 95%, p < 0,001.
37
Bảng 3.4. Kích thƣớc chiều rộng cổ và chiều dài đầu sán
Tỉnh n
Chiều rộng CW (mm) Chiều dài CL (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 3 4,5 3,67±0,48 2,5 4 3,16±0,45 Hà Nội 30 3 4,8 3,98±0,5 2,5 4,2 3,46±0,47 Nam Định 30 3,1 5,6 4,05±0,66 2,6 4,2 3,35±0,48 Nghệ An 30 3 5 3,78±0,53 2,5 4,2 3,3±0,44 Thanh Hóa 30 3 4,7 3,64±0,47 2,5 4 3,25±0,44 Tổng 150 3 5,6 3,82±0,55 2,5 4,2 3,3±0,46
Kích thƣớc trung bình của chiều rộng cổ sán là 3,82±0,55 mm (dao dộng từ 3 mm đến 5,6 mm). Kích thƣớc trung bình của chiều dài đầu sán là 3,3±0,46 mm (dao dộng từ 2,5 mm đến 4,2 mm).
Bảng 3.5. Kích thƣớc khoảng rộng và dài tinh hoàn
Tỉnh n
Khoảng rộng tinh hoàn TW (mm)
Khoảng dài tinh hoàn TL (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 5,1 7,8 6,49±0,75 16,5 24,1 19,08±2,48 Hà Nội 30 5 8 6,86±0,76 16 25 19,89±2,7 Nam Định 30 5,3 8 6,79±0,7 15 24 20,43±2,15 Nghệ An 30 5,7 8 6,73±0,56 17 23,6 20,2±2,12 Thanh Hóa 30 5,7 7,9 6,76±0,71 16 24 20,14±2,2 Tổng 150 5 8 6,72±0,7 15 25 19,95±2,36
Bảng 3.5 cho thấy kích thƣớc khoảng rộng tinh hoàn trung bình là 6,72±0,7 mm (dao dộng từ 5 mm đến 8 mm). Kích thƣớc khoảng chiều dài tinh hoàn trung bình là 19,95±2,36 mm (dao dộng từ 15 mm đến 25 mm).
38
Bảng 3.6. Kích thƣớc đoạn từ giác bụng đến cuối thân và đoạn từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân
Tỉnh n
VS-P (mm) Vit-P (mm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 25,7 37 30,54±3,33 6 13 9,36±2,2 Hà Nội 30 25,5 38 31,18±3,31 6,9 12,7 9,92±1,72 Nam Định 30 20,5 36 30,14±4,14 6,8 13 10,55±1,83 Nghệ An 30 26,7 35 31,32±2,18 7,8 14 11,1±1,57 Thanh Hóa 30 25 36 31,04±2,86 6,5 12,5 9,61±1,71 Tổng 150 25 38 30,85±3,22 6 14 10,11±1,9
Hình 3.2. So sánh tỷ lệ VS-P của sán lá gan lớn tại 5 tỉnh miền Bắc
Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.2 cho thấy khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân trung bình là 30,85±3,22 mm (dao dộng từ 25 mm đến 38 mm), khoảng cách từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân trung bình là 10,11±1,9 mm (dao dộng từ 6 mm đến 14 mm). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Bắc Giang
Hà Nội Nam Định Nghệ An Thanh Hóa 25.7 25.5 20.5 26.7 25 37 38 36 35 36 Min Max
39 Bảng 3.7. Sự phù hợp về loài sán theo chỉ số BL/BW và VS-P Loài sán Theo tỷ lệ BL/BW Theo VS-P n % n % F. hepatica-like 9 6 4 2,67 Fasciola sp.-like 51 34 9 6 F. gigantica-like 90 60 137 91,33
Theo tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán (Bảng 3.7) có 9 mẫu phù hợp với F. hepatica, 51 mẫu phù hợp với Fasciola spp., 90 mẫu phù hợp với F. gigantica.
Theo chỉ số VS-P, có 4 mẫu phù hợp với F. hepatica và 9 mẫu phù hợp với
Fasciola spp., 137 mẫu phù hợp với F. gigantica.
Hình 3.3. So sánh sự phù hợp về loài sán theo tỷ lệ (%) BL/BW và VS-P
Nhƣ đã nói ở trên, trong số các chỉ số hình thái của SLGL, các chỉ số BL, BW, VS-P và BL/BW là các chỉ số quan trọng để phân loại SLGL về mặt hình thái. Theo Periago và CS (2006) (Phụ lục 2), chỉ số VS-P ở F. hepatica là 12,4 – 25,08 mm (trung bình 20,79 ± 0,31), ở F. gigantica là 31,01 – 45,39 mm (trung bình 41,02 ± 1,21); chỉ số BL/BW ở F. hepatica là 1,65 – 2,76 (trung bình 2,27 ± 0,03), ở F. gigantica là 3,45 – 5,5 (trung bình 4,37 ± 0,17). Trong nghiên cứu của chúng
6
34
60
Sự phù hợp về loài sán theo chỉ số BL/BW (%)
F. hepatica-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like
2.67 6
91.33
Sự phù hợp về loài sán theo chỉ số VS-P (%)
F. hepatica-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like
40
tôi, chỉ số VS-P đo đƣợc dao động từ 25 – 38 mm (trung bình 30,85±3,22) và BL/BW từ 2,33 – 4,94 (trung bình 3,43±0,49). Nhƣ vậy, theo tỷ lệ BL/BW có 9 mẫu phù hợp với F. hepatica, 51 mẫu phù hợp với Fasciola sp., 90 mẫu phù hợp với F. gigantica; theo chỉ số VS-P, có 4 mẫu phù hợp với F. hepatica và 9 mẫu phù hợp với Fasciola sp., 137 mẫu phù hợp với F. gigantica. (Bảng 3.7).
Trƣớc đây, nhiều tác giả cho rằng ở Việt Nam có cả 2 loài F. hepatica và F. gigantica. Tuy nhiên, gần đây một số tác giả xác định loài SLGL trên trâu bò ở Việt Nam là F. gigantica [18, 5]; đặc biệt là có sự tồn tại của một dạng trung gian là dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica trong quần thể SLGL tại Việt Nam [16]. Kết quả của Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) khi nghiên cứu SLGL trên quần thể dê tại Việt Nam cho thấy đa số SLGL có kích thƣớc tƣơng ứng với
F. gigantica (> 35 mm x 12 – 15 mm), một số cá thể có hình thái giống F. hepatica (20 – 25 mm x 12 – 15 mm) và một số ít có kích thƣớc chiều dài trung gian (30 – 35 mm) [22]. Kết quả phân loại hình thái ở nghiên cứu này cũng chỉ ra loài SLGL trên trâu bò ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam là F. gigantica. Sự khác nhau giữa các kết quả có thể do việc phân loại dựa vào hình thái khó có thể xác định chính xác loài, nhất là các loài có họ hàng gần gũi do các loài này có sự đa hình về hình thái [9, 29]. Đối với SLGL, kích thƣớc và hình dạng của SLGL có thể thay đổi phụ thuộc vào vật chủ ký sinh, số lƣợng sán nhiễm ở vật chủ và tình trạng dinh dƣỡng của vật chủ, thời gian thu thập mẫu trong năm… Do tính đa hình về hình thái của SLGL nên chỉ dựa vào hình thái rất khó có thể phân biệt F. hepatica hay
F. gigantica [29]. Trong một nghiên cứu của Ghavami và CS (2009) cho thấy, trong 584 cá thể SLGL thu thập từ bò và cừu có 31 % số cá thể SLGL có hình thái giống F. hepatica, 7% giống F. gigantica và 62% giống Fasciola sp.; tuy nhiên, khi chọn ngẫu nhiên một số mẫu từ cả 3 nhóm đem so sánh trình tự gen với các mẫu chuẩn lại cho kết quả đều là F. hepatica [35].
41
Hình 3.4. Một số hình ảnh con sán lá gan lớn
(Ký hiệu mẫu: NAS 02: Nghệ An sán 02, NAS 04: Nghệ An sán 04, NĐS 02: Nam Định sán 02, THS 03: Thanh Hóa sán 03, THS 02: Thanh Hóa sán 02, BGS 02: Bắc Giang sán
02, HNS 01: Hà Nội sán 01, HNS 02: Hà Nội sán 02)
Hình 3.5. Hình thể và kích thƣớc mẫu SLGL tại một số điểm nghiên cứu
(Ký hiệu mẫu: HNS 02: Hà Nội sán 02, THS 03: Thanh Hóa sán 03, NĐS 02: Nam Định sán 02)
Kết quả hình thái học con SLGL trƣởng thành đa số là Fasciola gigantica. Dựa vào tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán có 90 mẫu phù hợp với F. gigantica,
chiếm 60% tổng số sán định loại (150 mẫu). Theo chỉ số VS-P, có 137 mẫu phù hợp với F. gigantica, chiếm 91,33% tổng số sán định loại.
42
3.1.2. Các chỉ số trứng SLGL thu đƣợc trên động vật (vật kính 40x)
Trứng SLGL trên động vật thu từ dịch mật trong túi mật của buồng gan trâu bò tại các điểm nghiên cứu. Đa số trứng có dạng thon dài, màu nâu vàng nhạt, có một nắp ở đầu, đầu còn lại có một gai nhỏ. Trứng SLGL đƣợc đếm số lƣợng, đo kích thƣớc chiều dài, chiều rộng và tính tỉ số chiều dài/chiều rộng.
(a) (b) (c) (d) Hình 3.6. Một số hình ảnh trứng sán lá gan lớn. Ảnh chụp trên vật kính 40x (hình a, b) và vật kính 10x (hình c, d), thƣớc đo = 10 µm Bảng 3.8. Các chỉ số kích thƣớc trứng thu trên động vật Tỉnh n
Chiều dài (µm) Chiều rộng (µm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 152 184 166,6±8,76 89 114 100,4±6,88 Hà Nội 30 150 179 168,8±6,59 91 104 98,1±5,52 Nam Định 30 157 182 168,8±6,58 92 108 102,2±5,39 Nghệ An 30 165 182 174,3±4,76 93 112 100,2±6,42 Thanh Hóa 30 160 182 172,4±6,6 90 112 102,1±5,64 Tổng 150 150 184 170,2±7,2 89 114 100,6±6,1
43
Kết quả bảng 3.8 cho thấy chiều dài của trứng SLGL dao động từ 150 µm đến 184 µm (trung bình 170,2±7,2 µm), chiều rộng dao động từ 89 µm đến 114 µm (trung bình 100,6±6,1 µm).
Bảng 3.9. Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng sán lá gan lớn thu trên động vật
Tỉnh n Tỷ số Dài/rộng Min Max TB Bắc Giang 30 1,4 2,06 1,66±0,13 Hà Nội 30 1,44 1,87 1,72±0,09 Nam Định 30 1,52 1,95 1,66±0,13 Nghệ An 30 1,5 1,89 1,75±0,12 Thanh Hóa 30 1,53 1,97 1,64±0,19 Tổng 150 1,4 2,06 1,69±0,12
Bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng SLGL dao động từ 1,4 đến 2,06 (trung bình 1,69±0,12).
Hình 3.7. So sánh tỷ lệ chiều dài/chiều rộng của trứng SLGL thu trên động vật 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Bắc Giang Hà Nội Nam Định Nghệ An Thanh Hóa 1.4 1.44 1.52 1.5 1.53 2.06 1.87 1.95 1.89 1.97 Min Max
44
Tiến hành đo kích thƣớc 150 trứng SLGL thu đƣợc từ dịch mật của buồng gan trâu bò, kết quả cho thấy: Chiều dài của trứng SLGL dao động từ 150 µm đến 184 µm (trung bình 170,2±7,2 µm), chiều rộng dao động từ 89 µm đến 114 µm (trung bình 100,6±6,1 µm). Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng SLGL dao động từ 1,4 đến 2,06 (trung bình 1,69±0,12).
Kích thƣớc trứng và tỷ lệ dài/rộng của trứng SLGL trong nghiên cứu này ở mức trung bình so với SLGL ở các nghiên cứu khác trong nƣớc và trên thế giới (Phụ lục 4). Nghiên cứu của Valero và CS (2009) tại Bolivia trên trâu bò cho kết quả kích thƣớc trứng F. hepatica có chiều dài dao động từ 105,3-155,9 µm (trung bình 132,0±10,5 µm), chiều rộng dao động từ 61,7-82,5 µm (71,14±4,3 µm), tỷ lệ dài/rộng là 1,6-2,3 (1,8±0,2); còn kích thƣớc của trứng F. hepatica trên lợn có chiều dài là 73,8-148,6 µm (123,8±11,3 µm), chiều rộng là 58,1-82,6 µm (71,8±4,4 µm). Cũng theo tác giả này, F. gigantica tại Burkina Faso có chiều dài dao động từ 129,6-204,5 µm (156,8±1,1 µm), chiều rộng dao động từ 61,6-112,5 µm (89,4±0,7 µm), tỷ lệ dài/rộng là 1,1-2 (1,7±0,2) (Phụ lục 4). Theo Nguyễn Thu Hƣơng và CS (2012) nghiên cứu tại Việt Nam cho kết quả chiều dài của Fasciola spp. trên ngƣời là 100-180 µm (152,5±1,75 µm), chiều rộng là 50-110 µm (79,39±1,43 µm), tỷ lệ dài/rộng là 1,4-2,6 (1,95±0,2) (Phụ lục 4). Nhƣ vậy, kích thƣớc trứng SLGL trong nghiên cứu này có kích thƣớc trung bình so với một số nghiên cứu khác tại Việt Nam, Hy Lạp, Iran, Ai Cập. Hầu hết trứng SLGL trong nghiên cứu này giống với trứng F. gigantica. Sự khác biệt này có thể do sự khác nhau của vật chủ mà sán ký sinh, mật độ sán nhiễm trong vật chủ…
3.2. Kết quả định loại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen ITS-2 bằng kỹ thuật PCR 3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen ITS-2 bằng kỹ thuật PCR
Chúng tôi tiến hành phân tích 150 mẫu con sán lá gan lớn, 150 mẫu trứng sán ở trâu bò tại 5 tỉnh (Bắc Giang, Hà Nội, Nam Định, Nghệ An, Thanh Hóa) và 14 mẫu trứng sán thu từ phân ngƣời. Sau khi tiến hành nhân bản gen bằng phản ứng PCR thu đƣợc 314 mẫu (bao gồm 150 mẫu con sán trƣởng thành và 164 mẫu trứng sán) cho sản phẩm ADN với các băng có kích thƣớc bằng nhau 1.000 bp, đây là kết quả của giống Fasciola spp.
45
Hình 3.8. Kết quả nhân gen mẫu SLGL bằng phản ứng PCR
3.2.2. Kết quả PCR - RFLP
Tiến hành phản ứng PCR-RFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn Tsp509I đối với các sản phẩm của phản ứng PCR, vì Tsp509I có thể tách riêng các loài Fasciola spp.. Enzyme này nhận biết chuỗi AATT trong ADN sợi đôi và cắt sau vị trí 0 trên mỗi mạch [47].
46
Kết quả ở hình 3.8 cho thấy trong số 150 mẫu con sán lá gan lớn trƣởng thành, chúng tôi thu đƣợc 150 mẫu bị cắt cho kết quả 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 213, 343 bp; không có mẫu nào bị cắt cho kết quả 4 băng ở các vị