a) Phương pháp pha loãng mẫu
Cân 1g phân cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý 9‰. Lắc đều bằng máy
lắc Vortex. Khi đó ta có độ pha loãng 10-1.
Dùng Micropipet hút 1ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối
sinh lý 9‰, trộn lên bằng Vortex ta có độ pha loãng 10-2.
Tiếp tục pha loãng như trên ta sẽ được các độ pha loãng tiếp theo cho đến khi đạt độ
pha loãng cần thiết. Mỗi lần chuyển từ nồng độ này sang nồng độ khác cần phải thay đầu cole vô trùng.
b) Phương pháp cấy mẫu
42
Hoà loãng giảm bật 1/10, 1/100, 1/1000 ... bằng dung dịch nước muối sinh lý 9‰
sao cho 1ml mẫu không vượt quá 30-300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch ở ba nồng độ pha
loãng cuối cùng, mỗi nồng độ 0.1ml cho vào đĩa môi trường MacConkey đã chuẩn bị
sẵn, mỗi nồng độ sử dụng 2-3 đĩa tương đương với 2-3 lần lập lại.
- Dùng que chang đã tiệt trùng chang đều dịch cấy cho đến khô.
- Lật ngược đĩa lại đem vào tủ ấm ủ mẫu ở 370C trong 24giờ.
- Sau thời gian ủ mẫu kiểm tra sự mọc của các đĩa, đếm số khuẩn lạc đặc trưng. Chọn
5 khuẩn lạc đặc trưng đem thử nghiệm các phản ứng sinh hoá để khẳng định vi khuẩn
E.coli.
Bảng 3.3 Định danh vi khuẩn E. coli bằng phản ứng sinh hóa (Carter, 1975)
Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn
Glucose, Lactose Indol MR VP Citrate H2S Lysine
E. coli Vàng + + - - - - c) Cách Tính Kết Quả N A (CFU/g ) = * R (n1 + 0.1 n2 + 0.01 n3) * V * d (Trần Linh Thước, 2006) (3.10)
N: Tổng số số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa
d: độ pha loãng của bật n1
n1: số đĩa nuôi cấy ở độ pha loãng đầu
n2, n3: số đĩa nuôi cấy ở các độ pha loãng tiếp theo
V : thể tích dung dịch pha loãng đem nuôi cấp R: là tỷ lệ khẳng định Mẫu 10-3 10-1 10-2 10-4 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml
43
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng đem kiểm tra sinh hoá
Tính kết quả
Hình 3.3 Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi khuẩn E.coli