CC, Silicagen; Aceton/CH 2Cl
Hình 3.5: Hình ảnh vi phẫu phiến lá ngón hoa vàng
3.2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế
Để chiết nhóm chất từ dƣợc liệu có thể sử dụng một trong số các phƣơng pháp hoặc kết hợp các phƣơng pháp sau: ngâm (ngâm nóng, ngâm lạnh), ngấm kiệt, chiết Soxhlet, chiết bằng siêu âm, chiết siêu tốc, chiết ngƣợc dòng. Việc lựa chọn các phƣơng pháp chiết phụ thuộc vào đặc điểm dƣợc liệu, nhóm hợp chất cần chiết, điều kiện phòng thí nghiệm và đặc biệt là mục đích sử dụng hỗn hợp chiết. Để chiết hợp chất để làm chất chuẩn đối chiếu thì yêu cầu về tính chọn lọc của quá trình chiết xuất đƣợc quan tâm hơn, để có thể thu đƣợc sản phẩm chiết ít tạp chất, thuận lợi cho quá trình phân lập và tinh chế tiếp theo. Một số yếu tố ảnh hƣởng chính đến quá trình chiết xuất dƣợc liệu nhƣ ảnh hƣởng của nhiệt độ, dung môi chiết cũng đã đƣợc khảo sát, nhằm lựa chọn điều kiện chiết tối ƣu cho mục đích nghiên cứu, ƣu tiên sử dụng các dung môi ít độc, dễ kiếm. Sau khi thu đƣợc dịch chiết toàn phần, thực hiện quá trình phân lập để tách riêng đối tƣợng nghiên cứu. Để phân lập các hợp chất tự nhiên có thể dùng một trong các kĩ thuật: sắc kí lớp mỏng điều chế, sắc kí cột, sắc kí lỏng điều chế, phân lập bằng phƣơng pháp phân bố vào dung môi. Các hợp chất đƣợc phân lập bằng kĩ thuật sắc kí cột, là kĩ thuật phổ biến nhất đƣợc thực hiện tại hầu hết các phòng thí nghiệm về hợp chất thiên nhiên. Kĩ thuật này không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và vận hành phức tạp nhƣ kĩ thuật sắc kí lỏng chân không
(VLC), PHPLC, hợp chất thu đƣợc sau phân lập đạt yêu cầu về độ tinh khiết để tiếp tục tinh chế làm chất đối chiếu trong giám định hóa pháp.
So sánh với tài liệu [73] và nghiên cứu này về phân lập, chiết tách các hợp chất từ lá cây trúc đào thì có sự khác nhau về hàm lƣợng cuối của các chất. Sự khác nhau này là vì trong nghiên cứu của [73], tác giả sử dụng nguyên liệu là lá trúc đào tƣơi, trong quá trình phân lập, chiết tách tác giả phải sử dụng sắc kí lỏng chân không để phân lập các hợp chất. Còn trong nghiên cứu này thì kỹ thuật sắc kí cột đƣợc dùng là chủ yếu và nguyên liệu là lá trúc đào khô, không cần phải sử dụng sắc kí lỏng chân không (giảm chi phí đầu tƣ) và thuận tiện cho việc phân lập các chất trong mẫu lá trúc đào.
Lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc), trúc đào phải đƣợc phơi ở bóng râm và không chế nhiệt độ dƣới 60oC để giữ cho hợp chất trong lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và các hợp chất glycosid tim trong lá trúc đào không bị phân hủy, sau đó sấy lá trong tủ sấy có quạt thông gió ở nhiệt độ 55oC và đảo đều. Việc sấy dƣợc liệu đảm bảo cho việc ổn định nguyên liệu, tránh phân hủy chất. Tiếp theo methanol đƣợc sử dụng làm dung môi chiết xuất các hợp chất trong lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc), trúc đào.
Phƣơng pháp dùng methanol để chiết xất là điểm mới của phƣơng pháp chiết xuất, phân lập các hợp chất trong lá, hoa trúc đào vì theo [6] tác giả đã sử dụng ethanol làm dung môi để chiết xuất oleandrin trong lá trúc đào khô, nhƣng oleandrin chiết xuất đƣợc còn lẫn nhiều tạp. Mặt khác trong nghiên cứu này cũng không sử dụng nƣớc làm dung môi chiết vì một số các hợp chất glycosid không tan trong nƣớc, do vậy nếu sử dụng nƣớc là dung môi chiết thì hiệu xuất sẽ không cao. Do đó trong nghiên cứu này dung môi đƣợc sử dụng để chiết xuất các hợp chất trong lá trúc đào khô là methanol và sau khi phân lập các hợp chất bằng sắc kí cột, các hợp chất thu đƣợc sạch hơn khi dùng ethanol để chiết xuất. Hàm lƣợng các chất thu đƣợc cũng tƣơng đối nhiều. Ngoài ra khi so sánh với các tài liệu [27], [42], [73] các tác giả chủ yếu dùng lá trúc đào tƣơi để phân lập các hợp chất. Nhƣng khi dùng lá trúc đào tƣơi để phân lập các hợp chất thì chi phí sẽ cao hơn do phải đầu tƣ thiết bị
sắc kí lỏng chân không để phân lập các hợp chất và quy trình phân lập cũng phức tạp hơn và dung môi sử dụng cũng nhiều hơn. Do đó khi sử dụng lá trúc đào khô để chiết tách, phân lập các hợp chất rất thuận lợi khi chỉ cần sử dụng sắc ký cột thƣờng mà không cần phải sử dụng sắc kí lỏng chân không.