CC, Silicagen; Aceton/CH 2Cl
c. Thử nghiệm chính thức
Các mức liều thử nghiệm:
Mức liều 1: 16mg mẫu thử/kg chuột Mức liều 2: 20mg mẫu thử/kg chuột Mức liều 3: 24mg mẫu thử/kg chuột Mức liều 4: 28mg mẫu thử/kg chuột Mức liều 5: 32mg mẫu thử/kg chuột Cách xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác một lƣợng mẫu thử, hòa tan trong dung dịch DMSO 0,1% thành hỗn dịch thử có nồng độ 0,8mg/ml (hỗn dịch thử).
d. Tiến hành:
- Chuột đƣợc nhịn ăn 15-18 giờ trƣớc khi thí nghiệm, nƣớc uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trƣớc khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng đƣợc đƣa vào thử nghiệm.
- Cách dùng: Đƣa mẫu thử dƣới dạng hỗn dịch theo đƣờng uống. Lấy thể tích mẫu thử theo quy định đƣa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù.
- Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 50 chuột, chia thành 5 nhóm thử theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử đƣợc uống hỗn dịch thử ở các mức liều và số lần đƣa mẫu thử theo bảng 3.18 và bảng 3.20:
2.3.5. Ứng dụng trong giám định hóa pháp
Hợp chất đã phân lập và xác định cấu trúc đƣợc ứng dụng làm mẫu đối chiếu trong giám định Hóa pháp.
Ứng dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao vào giám định Hóa pháp với chất đối chiếu là hợp chất đã phân lập đƣợc.
2.3.5.1. Ứng dụng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
Mẫu chiết từ phủ tạng nạn nhân nghi ngộ độc trúc đào đƣợc triển khai trên bản mỏng tráng sẵn và chất chuẩn đối chiết là oleandrin đã phân lập đƣợc.
- Hệ dung môi 1: aceton : toluen : ethanol : amoniac (45 : 45 : 7 : 3).
Dung môi triển khai đƣợc khoảng 9cm rồi lấy ra khỏi bình triển khai sắc ký và để cho khô. Soi dƣới đèn tử ngoại bƣớc sóng 254nm.
- Hệ dung môi 2: EtOAc : MeOH : H2O tỷ lệ (81 : 11 : 8).
- Thuốc thử hiện màu Kedde (3,5g dinitrobenzoic acid 2% trong ethanol). Trƣớc khi phun lấy 5ml thuốc thử Kedde trộn với 5ml NaOH 2%.
2.3.5.2. Khảo sát giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đƣợc lớn hơn độ không đảm bảo đo của phƣơng pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc.
2.3.5.3. Ứng dụng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu chiết từ phủ tạng nạn nhân ngộ độc trúc đào, mẫu đối chiếu là oleandrin đã đƣợc phân lập, đƣợc phân tích trên máy sắc kí lỏng hiệu năng cao - HPLC Agilent 1200, detector DAD, thể tích tiêm mẫu 10µl, cột sắc ký C-18. Hệ thống kiểm soát và xử lý số liệu đƣợc thực hiện với phần mềm ChemStation.
Điều kiện phân tích: Pha động acetonitril : acid formic 0,1% (Chạy gardien 90% acid formic:10% acetonitril đến 10% acid formic : 90% acetonitril trong thời gian từ 0 phút đến 50 phút), tốc độ dòng 0,5ml/phút. Dung môi và mẫu phân tích đƣợc lọc qua màng lọc 0,45µm trƣớc khi đƣa vào cột sắc ký. Detector DAD bƣớc sóng 245nm.
Chƣơng 3