NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, THỰC NGHIỆM
2.3.2.Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc
- Dựa trên những nguyên tắc, phƣơng pháp cơ bản của kĩ thuật chiết xuất dƣợc liệu để khảo sát lựa chọn điều kiện chiết xuất phù hợp (loại dung môi, pH dung môi, nhiệt độ…)
- Sử dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) để định tính hợp chất nghiên cứu trong dịch chiết dƣợc liệu và lựa chọn hệ dung môi phân lập bằng sắc kí cột.
- Sử dụng các phƣơng pháp đo điểm chảy, đo phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại - khả kiến, phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc.
Chiết xuất mẫu lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) bằng phương pháp ngâm chiết.
Mẫu lá tƣơi đƣợc phơi khô trong bóng râm rồi sấy ở 50oC trong vòng 3 giờ rồi xay nhỏ, lấy 2 kg bột lá chiết siêu âm 6 lần với methanol (1 giờ/lần, 3 lít/lần). Gộp các dịch chiết và cất loại hết dung môi thu đƣợc cắn. Pha loãng cắn đã cô đặc bằng 500 ml nƣớc cất rồi tiến hành chiết phân bố lần lƣợt với các dung môi n-hexan và
ethylacetat, mỗi dung môi chiết 3 lần (500ml/lần). Gộp dịch chiết từng loại và loại nƣớc bằng Na2SO4 khan cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các cặn chiết tƣơng ứng 20,0 g (cặn chiết bằng n-hexan) và 23,0 g (cặn chiết bằng ethylacetat).
Quy trình chiết xuất các chất trong lá cây ngón hoa trắng đƣợc trình bày trong hình 2.1.
Hình 2.1: Sơ đồ qui trình chiết mẫu lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)
Phân lập và tinh chế các hợp chất từ mẫu lá cây ngón hoa trắng bằng phương pháp sắc ký cột.
Cặn chiết từ n-hexan (20g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silicagel, giửa giải bằng hệ dung môi n-hexan và ethylacetat gradient nồng độ thu đƣợc 5 phân đoạn, ký hiệu F1 - F5. Rửa phân phân đoạn F1(650 mg) bằng aceton thu đƣợc chất rắn màu vàng, kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi n-hexan/ methanol thu đƣợc chất HC1 (70 mg). Với phân đoạn F2 (1500mg), rửa cắn bằng dung môi methanol thu đƣợc chất HC2 (50 mg). Phân đoạn F3 (1720 mg) tiếp tục đƣợc phân
lập bằng cột Sephadex LH-20, giửa giải bằng dung môi MeOH 100% thu đƣợc 3 phân đoạn, ký hiệu F3.1, F3.2 và F3.3. Phân đoạn F3.2 (300 mg) có dạng chất rắn màu vàng đƣợc kết tinh lại trong methanol thu đƣợc chất HC3 (115 mg).
Quá trình phân tách cặn n-hexan để phân lập các chất sạch đƣợc trình bày tóm tắt trong hình 2.2.
Cấu trúc hóa học của các chất phân lập ra đƣợc xác định bằng kết hợp các phƣơng pháp phổ nhƣ: Quang phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) nhƣ: 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT.
Hình 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)
Chiết xuất mẫu lá, hoa cây trúc đào bằng phương pháp ngâm chiết
- Mẫu lá cây trúc đào đƣợc thu hái vào tháng 5, theo GS. Đỗ Tất Lợi thì lá trúc đào có nhiều hoạt chất nhất là vào lúc cây sắp ra hoa, mùa hè và mùa thu, các mùa khác thì cho ít hoạt chất [6]. Phần lá cây trúc đào đƣợc phơi khô trong bóng râm để giữ cho glycosid tim không bị phân hủy [6], sau đó sấy lá trong tủ sấy ở nhiệt độ
550C, đảo đều liên tục, tử sấy phải có quạt thông gió. Nghiền nhỏ (16 kg) rồi đƣợc ngâm chiết 3 lần với methanol. Dịch chiết sau đó đƣợc cô đặc bằng máy cất quay dƣới áp suất giảm thu đƣợc 500g cặn. Hòa cặn với nƣớc cất và chiết lần lƣợt bằng n-hexan, chloroform và ethylacetat (mỗi dung môi 3 lần) thu đƣợc các cặn từ dịch chiết bằng n-hexan (60 g), chloroform (100 g) và ethylacetat (50 g) tƣơng ứng.
- Mẫu hoa cây trúc đào: Phần hoa của cây trúc đào sau khi thu hái về đƣợc phơi khô trong bóng râm (1.5kg) rồi đƣợc ngâm trong methanol. Dịch chiết sau đó đƣợc cô đặc bằng cất quay dƣới áp suất giảm thu đƣợc 50g cặn. Hòa cặn với nƣớc cất rồi chiết phân đoạn lần lƣợt với n-hexan, chloroform và ethylacetat (mỗi dung môi 3 lần). Cặn từ dịch chiết ethylacetat (20g), chloroform (6.9g), n-hexan (4.3g).
Hình 2.3: Sơ đồ qui trình chiết mẫu lá cây trúc đào
Phân lập và tinh chế các hợp chất từ mẫu lá, hoa cây trúc đào bằng phương pháp sắc ký cột pha thường và pha đảo.
Phần cặn CHCl3 tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha thƣờng, giải hấp bằng hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (tỷ lệ ethyl acetat tăng dần từ 0-
Lớp EtOAc Lớp nƣớc Lớp nƣớc Lớp n-hexan Chiết 3 lần bằng MeOH Thêm nƣớc Bổ sung n-hexan Bổ sung CHCl3 Bổ sung EtOAc Lớp CHCl3 Bột khô lá trúc đào (16 kg) Cặn từ dịch chiết MeOH (500g) Cặn từ dịch chiết n-Hexan (60g) Cặn từ dịch chiết CHCl3 (100g) Cặn từ dịch chiết EtOAc (50g) Cặn từ dịch chiết nƣớc
100%) thu đƣợc 6 phân đoạn ký hiệu là C1 C6. Phân đoạn C3 đƣợc tiếp tục phân tách trên cột sắc ký với chất hấp phụ là silicagel pha thƣờng sử dụng hệ dung môi rửa giải hexan:aceton - 3:1 thu đƣợc hợp chất NO1 (12 mg). Tiến hành phân lập phân đoạn C4 bằng sắc ký cột silicagel pha thƣờng, dung môi chloroform : aceton - 20 : 1, sau đó tiếp tục tiến hành sắc ký cột silicagel pha đảo YMC-RP 18, dung môi aceton : nƣớc - 3 : 1 thu đƣợc hợp chất NO2 (6 mg) và hợp chất NO3 (7 mg).
Hình 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết bằng CHCl3 lá trúc đào Tiến hành sắc ký cột sephadex HL-20 phân đoạn C5, hệ dung môi methanol:nƣớc - 1:1 và sắc ký cột silicagel pha thƣờng với hệ dung môi n-hexan : EtOAc - 2 : 1 thu đƣợc hợp chất NO8 (6 mg). Hợp chất NO10 (10 mg) và NO12 (8 mg) thu đƣợc từ phân đoạn C6 khi sử dụng lặp lại các sắc ký cột silicagel pha thƣờng và pha đảo. CC silicagel n-hexan/EtOAc 100/0 0/100 CC silicagel hexan/axeton 3/1 CC, silicagel Axeton/nƣớc 3/1 CC, Silicagel Hexan/EtOAc 2/1 CC, YMC- RP 18 MeOH/nƣớc 2/1 CC silicagel CHCl3/MeOH 15/1 CC Sephadex LH-20 MeOH/nƣớc 1/1 CC silicagel CHCl3/ axeton 20/1 Cặn từ dịch chiết Chloroform (100 g) C1 (23 g) C2 (26 g) C3 (9 g) C4 (12 g) C5 (17 g) C6 (12 g) NO1 (12mg) NO2 (6mg) NO3 (7mg) NO8 (6mg) C4.1 (300 mg) C5.2 (37 mg) NO10 (10mg) NO12 (8mg)
Hình 2.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn dịch chiết EtOAc lá trúc đào Phần cặn từ dịch chiết EtOAc: Tiến hành phân lập phần cặn từ dịch chiết EtOAc sử dụng sắc ký cột pha đảo YMC-RP 18, dung môi MeOH:nƣớc 1:3 thu đƣợc 3 phân đoạn ký hiệu là E1, E2, E3. Phân đoạn E1 đƣợc tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silica gel, sử dụng dung môi rửa giải CHCl3 : MeOH : H2O - 5 : 1 : 0,1 thu đƣợc hợp chất NO13 (8 mg). Phân đoạn E2 đƣợc tiến hành sắc ký cột silicagel dung môi rửa giải EtOAc : MeOH : H2O - 10 : 1 : 0,2 thu đƣợc hai phân đoạn nhỏ E2.1 và E2.2, tiến hành sắc ký cột YMC-RP 18 hai phân đoạn này với hệ dung môi rửa giải là aceton : H2O - 1 : 2 và MeOH : H2O - 1 : 1 thu đƣợc hợp chất NO15
(6mg), NO16 (7mg) và NO17 (5mg). Tiếp tục tiến hành sắc ký cột silicagel, dung môi CHCl3 : MeOH : H2O - 4 : 1 : 0,1 thu đƣợc hai hợp chất NO14 (6mg) và NO18
Hình 2.6: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn dịch chiết EtOAc hoa trúc đào Cấu trúc hóa học của các chất phân lập ra đƣợc xác định bằng kết hợp các phƣơng pháp phổ nhƣ: Quang phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) nhƣ: 1H- NMR, 13C- NMR, DEPT và so sánh với các số liệu phổ đã công bố.