Nghiên cứu về thực vật

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, THỰC NGHIỆM

2.3.1. Nghiên cứu về thực vật

 Làm tiêu bản mẫu cây.

 Thẩm định tên khoa học của cây trên cơ sở:

+ Phân tích đặc điểm hình thái, so sánh tham khảo các tài liệu tin cậy, so sánh với các mẫu thực vật lƣu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.

+ Lấy mẫu lá cây tƣơi để làm vi phẫu và phân tích DNA, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen của một số cây thuộc chi Jasminum.

 So sánh sự giống và khác nhau giữa kết quả vi phẫu, DNA của cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) với cây ngón hoa vàng (Gelsemium elegans).

Phương pháp vi phẫu:

Phƣơng pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về thực vật vẫn là quan sát, so sánh trên cơ sở các dữ kiện ngoài thiên nhiên, sau đó tiến hành giải phẩu trong phòng thí nghiệm, so sánh các mẫu vật thu thập đƣợc lƣu giữ qua bộ bách thảo tập hay hình ảnh, cuối cùng là phân tích, tổng hợp và rút ra nhận xét. Việc quan sát không những tiến hành trên cơ thể sống của thực vật mà còn cả trên những bộ phận đã chết của các cơ quan, kể cả các cơ quan đang hình thành, cùng với quá trình phát triển cá thể cũng nhƣ chủng loại phát sinh.

Các cấu trúc bên trong cơ thể thực vật đều đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi, nhƣ thế các mẫu vật cần phải đƣợc cắt lát thật mỏng theo những phƣơng hƣớng nhất định trong không gian (theo mặt phẳng ngang, mặt phẳng dọc hay tiếp tuyến). Khi cần quan sát sự hình thành một cơ quan, sự sắp xếp các mô hay sự biến đổi trong cấu tạo từ bộ phận này sang bộ phận khác hay theo dõi sự phân chia tế bào, cần tiến hành một loạt các lát cắt liên tiếp nhau ở nơi đó. Nhƣng nếu cần quan sát hình dạng riêng biệt của tế bào tách ra từ các mô thì sử dụng phƣơng pháp ngâm mủn tách rời các tế bào ra. Để phân biệt các loại tế bào hay thành phần cấu tạo các loại mô trong cơ quan, thƣờng các lát cắt đƣợc nhuộm màu và tùy theo yêu cầu quan sát phần nào mà sẽ nhuộm màu gì cho phù hợp. Trong phòng thí nghiệm thực vật, để nhận biết tế bào có vách bằng celuloz sẽ nhuộm đỏ bằng carmin, tế bào có vách tẩm mộc tố sẽ đƣợc nhuộm xanh với lục iod, nhân tế bào đƣợc nhuộm bằng hematoxylin ... Tùy

theo yêu cầu nghiên cứu hay sự quan sát mà có thể làm tiêu bản hiển vi tạm thời hay cố định.

Phần vi phẫu đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp sau:

 Dƣợc liệu tƣơi hay khô đã ngâm mềm cắt ngang hoặc cắt dọc bằng lƣỡi dao cạo hoặc dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng.

 Ngâm nƣớc Javen hay dung dịch cloramin để tẩy các chất có chứa trong các tế bào, thời gian ngâm tùy loại nguyên liệu, có thể rút ngắn thời gian bằng cách đun nóng.

 Rửa nƣớc: nếu vi phẫu có nhiều tinh bột cần tẩy thì sau khi rửa ngâm hoặc đun trong cloral hydrat rồi rửa nƣớc lần nữa.

 Rửa bằng acid acetic.

 Rửa bằng nƣớc.

 Nhuộm vi phẫu bằng lục iốt, lục metyl hoặc xanh metylen thời gian nhuộm tùy vào quá trình bắt màu của đối tƣợng (thƣờng khoảng 10 giây đến 1 phút).

 Rửa cồn, nếu dùng xanh metylen thì chỉ cần rửa bằng nƣớc.

 Nhuộm đỏ son phèn, thời gian nhuộm tùy đối tƣợng (có thể từ khoảng 1 phút đến 1 giờ).

 Rửa nƣớc.

 Ðặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính, soi trên kính hiển vi.

Vẽ sơ đồ tổng quát vi phẫu Dƣợc liệu và chụp ảnh vi phẫu dƣợc liệu.

Phương pháp giám định gen (DNA).

Phương pháp tách chiết DNA tổng số:

DNA tổng số đƣợc tách từ các mẫu lá theo phƣơng pháp của Doyle JJ và Doyle JL có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số của các mẫu.

Trình tự mồi

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu (bao gồm: matK, rbcLa,

rbcLc, psbA- trnH)

Tiến hành: Tính toán và pha nồng độ DNA tổng số của mẫu tƣơng đƣơng nhau trong khoảng từ 10-20 ng để khi đƣa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn là xấp xỉ nhau trong tổng thể tích 40µl/phản ứng.

Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong thể tích là 40µl với các thành phần gồm có: Master Mix Dream Taq Green 2X: 20l; MgCl2 25mM: 1l; Taq polymerase 5u/l : 0,5l; ADN mẫu: 2l; primer 10pmole mỗi loại: 1,25l và H2O. Chu trình nhiệt đƣợc thực hiên trên máy PCR system 9700 với các chu kỳ nhƣ sau: biến tính ở 950C 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 950C 30 giây; bắt cặp ở 560C 1phút với gen

rbcL, ở 500C trong 1 phút với gen matK và ở 480C trong 30 giây với gen psbA-

trnH; kéo dài mạch ở 720C 1 phút. Cuối cùng là 720C 10 phút để kết thúc phản ứng và giữ mẫu ở 40C. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy PCR system 9700.

Phương pháp điện di DNA trên gel agarose:

Điện di DNA là phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong cả phân tích định tính và định lƣợng mẫu DNA. DNA là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, khi đặt trong môi trƣờng có điện trƣờng các phân tử DNA có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thƣớc.

Gel agarose là loại gel thông dụng và phổ biến nhất, thao tác đơn giản, thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích những đoạn DNA có kích thƣớc khỏang 0,5 - 20 kb. Gel đƣợc đổ trên một giá thể nằm ngang.

Chúng tôi thực hiện điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Agarose 1%, sử dụng đệm TAE 1X, nhuộm gel bằng ethidium bromide 0,5%, thực hiện trên thiết bị điện di của hãng Biorab.

Đọc trình tự:

Kỹ thuật đọc trình tự DNA là kỹ thuật rất quan trọng dùng để xác định chính xác thành phần của phân tử DNA. Phân tử DNA đầu tiên đƣợc xác định trình tự là genome của bacteriophage X174 (5386 bp), đƣợc hoàn thành vào năm 1975. Tiếp theo là các trình tự của virus SV40 (5243 bp) vào năm 1977 và pBR322 (4363 bp). Dần dần đọc trình tự đƣợc áp dụng cho các phân tử DNA lớn hơn hơn.

phân hủy hóa học của Maxam và Gilbert (Mỹ) và phƣơng pháp xác định trình tự bằng đánh dấu huỳnh quang của Sanger (Anh). Cả hai phƣơng pháp đều cho phép đọc trình tự với độ dài vài kb trong thời gian ngắn nhất. Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam - Gilbert và Sanger đã mở ra một ứng dụng to lớn cho hệ thống học phân tử, cụ thể hơn là trong phân loại học phân tử, phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài và dƣới loài. Hiện nay phân tích hay đƣợc sử dụng trong phân loại học phân tử là so sánh trình tự DNA, sử dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử (alignment) để xác định mức độ sai khác về mặt di truyền. Các biến đổi phân tử đơn giản hơn rất nhiều so với các biến đổi hình thái vì vật chất di truyền DNA chỉ cấu thành từ 4 loại nucleotide là adenine (A), guanine (G), thymine (T) và cytosine (C). Mặt khác, các biến đổi phân tử ít bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi trƣờng. Ƣu thế lớn nhất của hệ thống học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm tƣơng đồng với đặc điểm tƣơng tự. Ngoài ra, nhiều phần của vật chất di truyền có nguồn gốc và kiểu biến đổi chung của mọi sinh vật, nên có thể so sánh trực tiếp bất kể nhóm sinh vật nào với nhau. Các biến đổi tiến hóa nhỏ (micro-evolution), hay đa dạng di truyền giữa các quần thể sinh vật cũng thể hiện qua các biến đổi phân tử rõ hơn so với các biến đổi hình thái.

Đọc trình tự DNA tự động giảm thiểu các thao tác thủ công và tăng tỷ lệ số liệu trình tự. Hiện nay, phƣơng pháp dideoxynucleotide hình thành một cơ sở đọc trình tự DNA tự động. Phân tích trình tự có thể đƣợc thực hiện bởi bốn thuốc huỳnh quang khác nhau, một loại cho mỗi phản ứng dideoxynucleotide, hoặc với cùng thuốc màu huỳnh quang cho mỗi phản ứng dideoxynucleotide trong mỗi hỗn hợp phản ứng. Nói chung, các hệ thống đọc trình tự DNA tự động có thể đọc với độ chính xác cao khoảng 500 base mỗi lần chạy, dƣới các điều kiện tối ƣu, một máy có thể phân giải khoảng 20.000 base mỗi giờ.

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc tiến hành giải trình tự trực tiếp từ cả hai đầu với cặp mồi matKF/matKR, rbcLaF/rbcLaR, rbcLcF/rbcLcR và psbA – trnH, sử dụng kit Bigdyes terminator cycler và tiến hành trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems Mỹ).

Phân tích số liệu:

Hình ảnh các peak của trình tự DNA các mẫu nghiên cứu đƣợc phân tích và ghép nối bằng phần mềm chromasPro, so sánh bằng phần mềm Clustal W, phân tích hệ số sai khác di truyền, vẽ cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm Mega 5.2.

Phân tích mối quan hệ di truyền-xây dựng cây phát sinh chủng loại:

Mối quan hệ di truyền của các loài đƣợc thể hiện bằng cây phát sinh chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, đƣợc xây dựng dựa trên sự giống và khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể. Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về cấu trúc DNA giữa các loài. Các taxon đƣợc nối với nhau trên cây thể hiện mối quan hệ di truyền. Phƣơng pháp Neighbor - Joining (NJ) là phƣơng pháp tạo cây thƣờng đƣợc sử dụng. Đây là một trong những phƣơng pháp xây dựng cây tiến hóa ít nhánh nhất. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là tìm ra thứ tự của các cặp hàng xóm (neighbor) hợp lý nhất làm giảm tổng chiều dài của cây tiến hóa.