2.5.3.1. Quan sát hình thái tế bào
Chủng vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MP, ở nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong thời gian 24 giờ. Cố định vi khuẩn tiêu bản để xác định Gram (-) hay Gram (+) (Phƣơng pháp nhuộm Gram đƣợc trình bày trong Phụ lục 2) đồng thời quan sát hình dạng tế bào của vi khuẩn dƣới kính hiển vi (có độ phóng đại 400 lần).
2.5.3.2. Xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của vi khuẩn
Để xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào, các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu đƣợc cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa môi trƣờng khoáng có bổ sung các cơ chất khác nhau trong thời gian 1 - 3 ngày ở 37oC nhƣ sau:
+ Bổ sung 0,2% carboxyl metyl cellulose (CMC) để xác định hoạt tính CMCase. Hiện màu bằng dung dịch Lugol (KI 5% (w/v) và I2 10% (w/v)), đo đƣờng kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch;
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
dung dịch Lugol, đo đƣờng kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch;
+ Bổ sung 0,5% casein để xác định hoạt tính protease. Hiện màu bằng dung dịch acid tricloacetic 50% (w/v), đo đƣờng kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch.
2.5.3.3. Xác định khả năng đối kháng của các vi khuẩn
Các chủng vi sinh vật tuyển chọn đƣợc nuôi cấy đồng thời trên cùng môi trƣờng MPA, sau 2 ngày nuôi cấy quan sát khả năng đối kháng trên đĩa petri [1].
2.5.3.4. Khả năng sử dụng các nguồn carbon sử dụng kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu sau khi nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào, đƣợc xác định khả năng đồng hóa các nguồn carbon và đƣờng bằng bộ kit chuẩn sinh hóa API 50CHB (Bio Mérieux, Pháp). Trình tự các bƣớc thí nghiệm đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau:
- Chủng vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MPA trong 24 giờ.
- Hòa tan một vòng que cấy chứa sinh khối vi khuẩn vào trong 2,0 ml nƣớc muối sinh lý.
- Hút 200 μl dịch huyền phù vi khuẩn bổ sung vào môi trƣờng khoáng kèm theo bộ kit.
- Dùng dầu parafin phủ kín lên bề mặt các giếng thử. - Đậy bộ kít thử và nuôi ở nhiệt độ 30oC.
- Đọc kết quả sau 24 giờ.
- Tra bảng kết quả và so sánh độ tƣơng đồng bằng phần mềm API Plus
2.5.3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến khả năng phát triển của vi khuẩn
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
- Ảnh hưởng của pH: Các chủng vi khuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng LB có pH
ban đầu lần lƣợt là: 6, 7, 8, 9, 10 và nuôi ở nhiệt độ 30o
C, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau 48 giờ đo OD600nm để xác định sự sinh trƣởng của vi khuẩn.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng LB ở
pH thích hợp trong dải nhiệt độ: 25oC, 30oC, 37oC, 40oC, 45oC, 50oC. Sau 48 giờ nuôi lắc 200 vòng/phút, đo giá trị OD600nm để xác định sự sinh trƣởng của vi khuẩn.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/