thu chế phẩm sinh học
3.1.2.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp
Chất dinh dƣỡng bao gồm các nguồn carbon, nguồn nitơ, các muối khoáng và vitamin là nguyên liệu cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp các chất, các enzyme tạo ra các thành phần của tế bào và phục vụ quá trình trao đổi năng lƣợng ở vi sinh vật. Do vậy, việc tìm ra môi trƣờng tối ƣu với các nồng độ các chất trong đó quan trọng nhất là tìm đƣợc tỷ lệ carbon/ nitơ để quá trình lên men có thể thu đƣợc lƣợng sinh khối cao là nhiệm vụ quan trọng. Ba chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong các môi trƣờng khác nhau trên máy lắc 220 vòng/phút ở 300
C trong 24 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Khả năng sinh trƣởng của ba chủng lựa chọn trên một số môi trƣờng Môi trƣờng Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn
(OD600nm) P. plecoglossicida PK 1.19 B. amyloliquefaciens ND1.15 P. putida ND1.9 AM1 3,18 3,04 3,22 AM2 3,53 3,11 3,15 MT3 3,34 2,96 3,16 MT4 3,06 2,32 2,62 MT5 1,85 1,97 1,85
Qua kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, thành phần môi trƣờng có tác động rất lớn đến khả năng sinh trƣởng của các chủng lựa chọn. Chủng ND 1.9 sinh trƣởng tốt
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
nhất trên môi trƣờng AM1, OD600nm đạt 3,22; hai chủng ND1.15 và PK1.19 sinh trƣởng mạnh trên môi trƣờng AM2, OD600nm đạt lần lƣợt là 3,11 và 3,53. Do vậy, môi trƣờng AM1 và AM2 đƣợc lựa chọn để nuôi cấy thích hợp cho ba chủng vi khuẩn nói trên.
3.1.2.2. Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh trƣởng của các chủng lựa chọn
a. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Sự thay đổi pH là do nồng độ ion H+ trong môi trƣờng tạo nên. Nồng độ ion H+ trong môi trƣờng đã tác động đến hoạt động của các enzyme trong tế bào, ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Trên cơ sở môi trƣờng thích hợp đã nghiên cứu ở phần trên, kết quả đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của ba chủng vi khuẩn PK 1.19, ND1.15, và ND1.9 tại pH 6,0 đến pH 10,0. Ba chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên các môi trƣờng thích hợp trên máy lắc 220 vòng/phút ở 300C trong 24 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sự sinh trƣởng của ba chủng lựa chọn
pH ban đầu
Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn (OD600nm) P. plecoglossicida PK 1.19 B. amyloliquefaciens ND1.15 P. putida ND1.9 6 2,96 3,02 3,84 7 3,44 3,76 2,58 8 3,12 2,85 2,32 9 2,06 1,84 1,64
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
10 1,53 1,68 1,10
Kết quả của bảng 3.9 cho thấy, cả ba chủng vi khuẩn lựa chọn phát triển tốt trong khoảng pH 6 - 8, sinh trƣởng đạt cực đại ở pH = 6 đối với chủng ND1.9; pH = 7 đối với chủng ND1.15 và PK1.19. Với pH ban đầu 9 sinh trƣởng của các chủng lựa chọn giảm. Do đó, pH môi trƣờng ban đầu là 6 - 7 đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
b. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ môi trƣờng đối với vi khuẩn có mối quan hệ mật thiết đến quá trình sinh trƣởng tăng sinh khối của vi khuẩn. Đối với mỗi loại vi khuẩn đều có nhiệt độ phát triển tối thiểu, tối thích và nhiệt độ phát triển tối đa. Do vậy, chúng tôi nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trƣởng của ba chủng vi khuẩn lựa chọn ở các thang nhiệt độ thay đổi từ 25oC – 45oC.
Ba chủng PK 1.19, ND1.15 và ND1.9 sau khi chọn lựa đƣợc môi trƣờng thích hợp và pH ban đầu và nuôi ở dải nhiệt độ 25oC, 30oC, 37oC, 40oC, 45oC, 50oC. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng của ba chủng vi
khuẩn P. plecoglossicida PK 1.19, B.amyloliquefaciens ND1.15, và P. putida
ND1.9
Nhiệt độ (oC)
Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn (OD600nm)
P. plecoglossicida PK 1.19 B. amyloliquefaciens ND1.15 P. putida ND1.9 25 4,52 3,86 4,45 30 6,75 6,08 5,54 37 6,23 5,94 6,62
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
40 5,74 5,03 5,45
45 4,01 3,66 4,10
Qua bảng 3.10 cho thấy, nhiệt độ tối thích của cho sinh trƣởng các chủng PK1.19 và ND1.15 là 30oC (OD600nm đạt lần lƣợt là 6,75 và 6,08). Chủng ND1.9 sinh trƣởng mạnh nhất ở 37oC đo OD600nm đạt 6,62. Mặc dù hai chủng vi khuẩn PK 1.19 và ND1.9 đều thuộc chi Pseudomonas nhƣng có nhiệt độ sinh trƣởng tối thích khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas thƣờng có nhiệt độ phát triển tối thích là 28 - 30oC, nhƣng cũng có một số vi khuẩn thuộc chi này có nhiệt độ phát triển cao hơn, đặc biệt là các vi khuẩn phân lập từ đất tại các vùng có khí hậu nóng. Kết quả trong cho thấy các chủng lựa chọn là các chủng ƣa ấm và lựa chọn 30o
C và 37oC là nhiệt độ nuôi trong các nghiên cứu tiếp theo lần lƣợt đối với các chủng P. plecoglossicida PK 1.19, B. amyloliquefaciens ND1.15
và P. putida ND1.9.
c. Ảnh hưởng của độ thông khí
Khi lên men chìm, oxy là một trong các yếu tố cơ bản ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí cũng nhƣ quá trình trao đổi chất trong tế bào do vi sinh vật chỉ sử dụng oxy hòa tan trong môi trƣờng. Tính chất này có liên quan đến sự phân bố hệ enzyme hô hấp trong tế bào chất. Lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc thƣờng thấp, tế bào sử dụng oxy để hô hấp và làm giảm lƣợng oxy trong môi trƣờng, vì thế trong nuôi cấy hiếu khí phải cung cấp oxy một cách đều đặn. Do đó, các nghiên cứu đƣợc thực hiện dựa trên sự thay đổi thể tích môi trƣờng nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của thế tích dịch trên thể tích bình nuôi của các chủng lựa
Vmôi trƣờng (ml)*
Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn (OD600nm) P. plecoglossicida PK 1.19 B. amyloliquefaciens ND1.15 P. putida ND1.9
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
25 4,96 5,50 4,58
50 5,73 6,86 6,72
75 5,26 6,64 5,84
100 4,42 5,48 3,26
Ghi chú: * Thể tích môi trường nuôi cấy được thí nghiệm trong các bình tam giác
có thể tích 250 ml
Kết quả ở bảng 3.11 nhận thấy, độ thông khí ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của ba chủng lựa chọn và các chủng lựa chọn có nhu cầu sử dụng oxy cao trong quá trình phát triển. Ở tỷ lệ thể tích môi trƣờng là 50 ml/thể tích bình nuôi 250 ml (chiếm 20%(v/v)) khả năng phát triển của cả ba chủng vi khuẩn là cao nhất. Do vậy, chúng tôi chọn thể tích môi trƣờng 50 ml/bình 250 ml cho các nghiên cứu tiếp theo. Khi nuôi cấy trong các bình tam giác có dung tích lớn hơn, tỷ lệ thể tích môi trƣờng/thể tích bình (%) là 20% đƣợc sử dụng để thực hiện nghiên cứu.
d. Nghiên cứu thời gian lên men thích hợp cho vi khuẩn
Trên cơ sở môi trƣờng và điều kiện lên men thích hợp cho sinh trƣởng của ba chủng PK 1.19, ND1.15 và ND1.9, quá trình lên men đƣợc điều chỉnh trong hệ thống bình lên men tự động Bioflo110 (Newbrunswick scientific, Mỹ) (Phụ lục 4) có dung tích 7,5 lít. Động thái quá trình sinh trƣởng của ba chủng PK1.19, ND1.15 và ND1.9 (Phụ lục 4) với các thông số lên men ban đầu: pH = 6, nhiệt độ 37oC (đối với chủng P. putida ND1.9); pH = 7, nhiệt độ 30oC (đối với chủng P.
plecoglossicida PK 1.19, B. amyloliquefaciens ND1.15); tốc độ thổi khí 0,5
lít/lít/phút, tốc độ khuấy 500 vòng/phút (đƣợc tính toán tƣơng đồng với lên men khi thể tích dịch lên men/thể tích bình tam giác là 20% trên máy lắc tròn tốc độ 220 vòng/phút). Kết quả thể hiện ở hình 3.6.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian lên men tới sinh trƣởng của ba chủng vi khuẩn
PK 1.19, ND1.15 và ND1.9
Động thái quá trình sinh trƣởng của 3 chủng PK1.19, ND1.15 và ND1.9 phù hợp với động học của quá trình sinh trƣởng nói chung của vi khuẩn (Hình 3.6). Thời điểm kết thúc quá trình lên men thu sinh khối tốt nhất ở 33 giờ, tại thời điểm này lƣợng sinh khối của 3 chủng PK1.19; ND1.15 và ND1.9 thu đƣợc là cực đại OD600nm đo đƣợc lần lƣợt là 4,63; 4,52 và 4,10. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, sinh khối của các chủng không tăng mà có xu hƣớng giảm. Nhƣ vậy, có thể kết thúc quá trình lên men thu sinh khối tạo chế phẩm vi sinh ứng dụng trong xử lý nƣớc thải tại thời điểm 33 giờ.