3.1.1.1. Mật độ vi sinh vật trong các mẫu nƣớc thải lò giết mổ
Để thực hiện nghiên cứu, các mẫu nƣớc thải sử dụng đƣợc thu thập từ 05 cơ sở giết mổ lợn tập trung tại địa bàn Hà Nội. Mật độ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc trong các mẫu nƣớc thải giết mổ đƣợc thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần vi sinh vật có trong các mẫu nƣớc thải giết mổ
Mẫu Mật độ vi sinh vật (CFU/ml) Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc PK1 5,3 x 105 1,0 x 103 6,0 x 102 ND1 4,4 x 106 4,0 x 103 1,0 x 102 ND2 4,4 x 107 - - TL1 3,4 x 106 1,1 x 102 - TL2 1,5 x 106 2 x 103 1,0 x 102
Có thể thấy khu hệ vi sinh vật trong các mẫu thu thập đƣợc rất đa dạng về số lƣợng và chủng loại. Mật độ trung bình của vi khuẩn dao động từ 5,3 x 105 đến 4,4 x 107CFU/ml, của xạ khuẩn từ 1,1 x 102 đến 4 x 103CFU/ml và nấm mốc khoảng 3,0 x 102CFU/ml. Mật độ vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với chỉ tiêu công bố trong nƣớc khác về chỉ tiêu trung bình của nƣớc thải giết mổ [5], [11].
3.1.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng loại bỏ các hợp chất chứa N, P
Khi thực hiện xử lý sơ bộ trên mô hình USBF bằng bùn hoạt tính lấy tại cơ sở xử lý nƣớc thải khác thì khả năng xử lý nitơ (trong ngăn thiếu khí), và tích tụ P
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
trong hệ đệm vi khuẩn chƣa triệt để nên cần tăng cƣờng xử lý hiếu khí (nhằm loại bỏ nitơ dƣ và P nhờ tích lũy vào sinh khối trong ngăn xử lý hiếu khí) (kết quả không công bố). Do vậy, mục tiêu của nghiên cứu là tạo ra chế phẩm sinh học tăng cƣờng quá trình xử lý nƣớc thải hiếu khí trong mô hình USBF.
Để tạo chế phẩm vi sinh hỗ trợ cho quá trình xử lý hiếu khí trong mô hình USBF, vi khuẩn đƣợc lựa chọn làm đối tƣợng chính do khả phát triển tốt, có khả năng tích hợp vào bùn hoạt tính sẵn có, tốc độ lắng tốt, có khả năng tích lũy phospho và nitơ vào sinh khối tế bào khi xử lý trong ngăn hiếu khí nên đƣợc tập trung nghiên cứu.
Từ 5 mẫu nƣớc, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết đƣợc 54 chủng vi khuẩn, trong đó có 11 chủng bƣớc đầu đƣợc định tính là có khả năng xử lý nitơ và photpho trong môi trƣờng nƣớc thải nhân tạo chứa nitơ và phospho. Trong số 11 chủng, ba chủng PK1.19, ND1.15 và ND1.9 đƣợc lựa chọn dựa trên khả năng xử lý phospho, nitơ trong môi trƣờng nƣớc thải lỏng trong điều kiện hiếu khí. Kết quả đánh giá khả năng xử lý nitơ và phospho của vi khuẩn trong ngăn hiếu khí khi áp dụng đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng xử lý P, N của ba chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn trên nền là
bùn sinh học trong điều kiện hiếu khí sau 24 giờ
Chủng Nitơ tổng (mg/l) Phospho tổng (mg/l) Khả năng xử lý N (%) Khả năng xử lý P (%) 0 giờ 24 giờ 0 giờ 24 giờ
PK1.19 86,2 49,66 2,07 1,75 42,3 15,45
ND1.15 83,52 36,94 1,84 1,66 55,77 9,78
ND1.9 85,31 38,23 1,69 1,53 55,18 9,46
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
và N. Trong đó, khả năng xử lý P của chủng PK1.19 chiếm ƣu thế hơn hẳn so với hai chủng còn lại. Khả năng xử lý P cao nhất của chủng vi khuẩn PK1.19 đƣợc đánh giá thông qua khả năng tích tụ P trong sinh khối vi khuẩn (đạt 15,45 % sau 24 giờ xử lý). Hai chủng ND1.15 và ND1.9 có khả năng xử lý N hữu cơ nhờ quá trình tích lũy N vào sinh khối trong điều kiện hiếu khí. Hiệu suất xử lý N đạt lần lƣợt là 55,77 và 55,18%. Mặc dù hiệu suất xử lý N và P bƣớc đầu đạt đƣợc của từng chủng chƣa cao nhƣng ba chủng tuyển chọn đƣợc có khả năng xử lý nitơ và phospho tốt nhất từ Bộ sƣu tập giống vi khuẩn phân lập trong nƣớc thải giết mổ. Nhƣ vậy ba chủng vi khuẩn PK1.19; ND1.15 và ND1.9 bƣớc đầu đƣợc xác định có tiềm năng ứng dụng trong tạo chế phẩm xử lý nƣớc thải giầu P, N.
3.1.1.3. Đặc điểm sinh học của ba chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn a. Đặc điểm sinh học của ba chủng vi khuẩn
Kết quả nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc của ba chủng PK1.19, ND1.15 và ND1.9 đƣợc trình bày trong bảng 3.3 và minh họa trên hình 3.1.
Bảng 3.3. Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của ba chủng vi khuẩn PK1.19, ND1.15
và ND1.9
Đặc điểm Chủng PK1.19 ND1.15 ND1.9
Tốc độ sinh trƣởng Tốt Tốt Tốt
Hình dáng khuẩn lạc Tròn Tròn Tròn đều
Bề mặt khuẩn lạc Lồi, mịn, bóng Phẳng, khô Khô
Mép khuẩn lạc Răng cƣa Răng cƣa Tròn
Màu sắc khuẩn lạc Trắng sữa Nâu sáng Trắng sữa
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Tính chất khuẩn lạc Khô Khô Khô
Kích thƣớc khuẩn lạc 0,5 - 1 mm 3 – 5 mm
Hình dạng tế bào Hình que Hình que Hình que
Khả năng di động Có Có Có
Tiêm mao Có Có
Khả năng sinh bào tử Không Có Không
Gram - + -
Nhiệt độ sinh trởng Ƣa ấm (30o
C) Ƣa ấm (37o C) Ƣa ấm (30o C) pH sinh trƣởng 5 - 9 5 – 8 6 - 8 A B C D E F
Hình 3.1. Hình ảnh minh họa đặc điểm khuẩn lạc (A, C, E) và hình thái tế bào (B,
D, F) lần lƣợt của các chủng vi khuẩn PK1.19, ND1.15 và ND1.9. Kết quả trong bảng 3.3 và hình 3.1 cho thấy:
- Chủng PK1.19 có khả năng phát triển tốt trên môi trƣờng kiểm tra, khuẩn lạc nhỏ có đƣờng kính 0,5 – 1 mm, mép khuẩn lạc có dạng răng cƣa, bề mặt khuẩn lạc lồi, mịn và bóng; chủng PK1.19 có dạng hình que ngắn, kích thƣớc 0,7 x 2,0 µm, sau 48 giờ không quan sát thấy bào tử, là vi khuẩn Gram (-) điển hình (Hình 3.1B).
- Chủng ND1.15 phát triển tốt trên môi trƣờng kiểm tra, khuẩn lạc to (đƣờng kính 3 - 5 mm), mép khuẩn lạc có dạng răng cƣa, bề mặt trên khuẩn lạc phẳng khô
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
có màu nâu sáng, mặt dƣới khuẩn lạc có màu vàng nhạt, tế bào có dạng que ngắn, kích thƣớc 0,7 - 2,0 µm, sau 48 giờ không quan sát thấy bào tử và là vi khuẩn Gram (+) điển hình (Hình 3.1D).
- Chủng ND1.9 phát triển tốt, khuẩn lạc to, mọc riêng rẽ, mép khuẩn lạc tròn, bề mặt khuẩn lạc lồi, khô, bóng, khuẩn lạc có màu trắng sữa, mặt dƣới khuẩn lạc không màu, tế bào có dạng hình que, bắt thuốc nhuộm màu hồng. Nhƣ vậy chủng ND1.9 là vi khuẩn Gram (-), (Hình 3.1F).
b. Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon và Nito của ba chủng vi khuẩn PK1.19, ND1.15 và ND1.9
Cacbon và nitơ là thành phần cấu tạo nên nhiều hợp chất cần thiết khác nhau cho sự sống và là thành phần dinh dƣỡng thiết yếu đối với vi sinh vật để sinh trƣởng và phát triển. Do vậy, việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn cacbon và nitơ của các chủng vi khuẩn là hết sức cần thiết. Kết quả trong Phụ lục 3 thể hiện khả năng sử dụng carbon và nitơ của ba chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu nhƣ sau:
Bảng 3.4. Khả năng sử dụng nguồn đƣờng và nitơ của chủng PK1.19 Nguồn đƣờng Khả năng phát
triển
Nguồn Nitơ Khả năng
phát triển
Đối chứng - Không bổ sung nguồn N -
D-xylose - Histidin +
L-rhamnose + Tryptophan +
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ D-fuctose + KNO3 + D-saccharose + (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O + D-lactose - NH4 NO3 + D-manltose + (NH4)2HPO4 + D-rafinose - NH4Cl + D-manitol + (NH4)2SO4 + Ghi chú: “+” có phát triển “-” không phát triển
- Chủng vi khuẩn PK1.19 có khả năng đồng hóa tốt các loại đƣờng và tất cả các nguồn nitơ kiểm tra, không có khả năng đồng hóa đƣợc các đƣờng D-xylose; D-lactose; D-rafinose.
Bảng 3.5. Khả năng sử dụng nguồn đƣờng và nitơ của chủng ND1.9
Khả năng đồng hóa
Khả năng phát triển
Khả năng đồng hía Khả năng phát triển Đồng hoá glucose + Gluconate + Arabinose - Caprate - Manose + Adipate + Manitol + Malate + N-acetyl glucosamin + Citrate +
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Maltose + Phenyl-acetate -
Ghi chú: “+” có phát triển
“-” không phát triển
- Chủng vi khuẩn ND1.9 có khả năng đồng hóa tốt các loại đƣờng và các nguồn nitơ kiểm tra, không có khả năng đồng hóa arabinose, caprate, phenyl- acetate…
Bảng 3.6. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn ND1.15
Phản ứng
Cơ chất Phản
ứng
Cơ chất
Đối chứng - ESC Esculin +
GLY Glycerol - SAL Salicin +
ERY Erythritol + CEL D-cellobiose - DAR
A
D-arabinose - MAL D-manltose + LAR
A
L-arabinose - LAC D-lactose - RIB D-ribose + MEL D-melibiose - DXY
L
D- xylose - SAC D-saccharose + LXY
L
L- Xylose - TRE D-trehalose +
ADO D-adonitol - INU Inulin -
MDX Metyl- -D- xylopyranoside
- MLZ D-melezitose - GAL D-galactose - RAF D-raffinose -
GLU D-glucose + AMD Amidon +
RRU D-fructose + GLYG Glycogen -
MNE D-manose + XLT Xylitol -
SBE L-sorbose - GEN Gentiobiose + RHA L-rhamnose - TUR D-turanose +
DUL Dulcitol - LYX D-lyxose -
INO Inositol - TAG D-tagatose + MAN D-manitol + DFUC D-fucose - SOR D-sorbitol + LFUC L-Fucose - MD M Metyl- -D- manopyranosid e - DARL D-arabitol -
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ MDG Metyl- -D- glucopyranside - LARL L-arabitol - NAG N-Acetyl- Glucosamine + GNT Potassium gluconate + AMY Amygdalin - 2KG Potassium 2-
ketogluconate
- ARB Arbutin - 5KG Potassium 5-
ketogluconate
-
- Chủng ND1.15 đƣợc xác định đặc điểm sinh hóa bổ sung bằng kit API 50CHB (BioMérieux, Pháp). Khi so sánh đặc điểm sinh hóa của chủng ND1.15 với cơ sở dữ liệu bằng phần mềm APILAB plus; đặc điểm hình thái khóa phân loại vi khuẩn Bergey’s cho thấy chủng ND1.15 có đặc điểm tƣơng đồng với loài Bacillus amyloliquefaciens.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Đặc điểm sinh hóa của chủng ND1.15 sau 48 giờ (sử dụng kit API
50CHB (BioMérieux, Pháp)
c. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn PK1.19; ND1.15; ND1.9
Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, khả năng sinh tổng hợp ba loại enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn đƣợc thể hiện trong bảng 3.7.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Bảng 3.7. Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của ba chủng vi khuẩn
PK1.19, ND1.15, ND1.9
Hoạt tính
enzyme Cơ chất Đƣờng kính vòng phân giải (D-d) mm
PK1.19 ND1.15 ND1.9 CMCase CMC 9 3,2 2,8 Amylase Tinh bột 12 4,1 5,2 Protease Casein 11 3,6 2,3 Lipase Tributyrin 6,5 4,1 0 Ghi chú:
D: Đường kính vòng phân giải (mm) d: Đường kính khuẩn lạc (mm)
Kết quả trong bảng 3.7 cho thấy, các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có khả năng sinh tổng hợp cả 3 loại enzyme ngoại bào CMCase, amylase, protease. Trong đó chủng PK1.19 có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao hơn 2 chủng còn lại. Nhƣ vậy, các chủng này có khả năng ứng dụng trong xử lý nƣớc thải có chứa cellulose, protein và tinh bột.
d. Tính đối kháng của ba chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Nhằm đánh giá khả năng ức chế phát triển khi cùng sử dụng 03 chủng vi khuẩn trên trong xử lý nƣớc thải giết mổ, các chủng vi khuẩn nghiên cứu đƣợc kiểm tra khả năng sinh trƣởng và phát triển trên cùng một môi trƣờng. Hình 3.3 thể hiện tính đối kháng của ba chủng vi khuẩn khi cùng nuôi cấy trên môi trƣờng thạch.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ môi trƣờng MPA
Kết quả trên hình ảnh cho thấy ba chủng vi khuẩn không đối kháng lẫn nhau, khả năng phát triển của các chủng trên môi trƣờng đặc trƣng tƣơng đối đồng đều. Do vậy, có thể sử dụng hỗn hợp ba chủng vi khuẩn khi xử lý nƣớc thải giết mổ.
3.1.1.4. Phân loại các chủng vi khuẩn nghiên cứu
a. Tách chiết DNA tổng số
Kết quả trên hình 3.4A cho thấy, quá trình tách chiết DNA tổng số của ba chủng nghiên cứu tạo ra băng có kích thƣớc lớn chứng tỏ kết quả tách DNA đƣợc thực hiện thành công và có thể sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA của các chủng vi khuẩn
b. Khuếch đại gen 16S rDNA của các chủng PK1.19; ND1.15 và ND1.9
Khi thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F và 14R để khuếch đại gen 16S rDNA của các chủng PK1.19; ND1.15 và ND1.9 cho một băng DNA rõ nét duy nhất có kích thƣớc khoảng 1400 bp trên bản gel agarose 1% (Hình 3.4B). Sản phẩm PCR tiếp tục đƣợc tinh sạch và sử dụng trong thí nghiệm giải trình tự gen.
A B
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
tổng số của các chủng PK1.19; ND1.15 và ND1.9 (A); Điện di đồ sản phẩm PCR; M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-3 sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA của
chủng PK1.19; ND1.15 và ND1.9 (B)
c. Phân loại các chủng vi khuẩn dựa vào phân tích trình tự gen 16S rDNA của ba chủng vi khuẩn PK1.19, ND1.15 và ND1.9
Khi so sánh các trình tự gen 16S rDNA của ba chủng PK1.19, ND1.15 và ND1.9 với các trình tự gen tƣơng ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy: gen 16S rDNA của chủng PK1.19 có độ tƣơng đồng cao (99%) so với gen tƣơng ứng của chi Pseudomonas
plecoglossicida; gen 16S rDNA của chủng ND1.15 có độ tƣơng đồng cao (99%) so
với gen tƣơng ứng của chi Bacillus; gen 16S rDNA của chủng ND1.9 có độ tƣơng đồng cao (99%) so với gen tƣơng ứng của loài Pseudomonas putida.
Tổng hợp các kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa kết hợp với phân tích trình tự gen 16S rDNA của ba chủng vi khuẩn có thể phân loại ba chủng vi khuẩn PK1.19, ND1.15 và ND1.9 lần lƣợt thuộc các loài Pseudomonas
plecoglossicida, Bacillus amyloliquefaciens và Pseudomonas putia. Theo các tài
liệu công bố, ba loại vi khuẩn trên đều thuộc nhóm vi khuẩn không gây bệnh và an toàn đối với sinh thái, ngƣời sử dụng. Vi khuẩn B. amyloliquefaciens đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp các enzyme thủy phân nhƣ amylase, protease… và ứng dụng trong xử lý hồ nuôi tôm, xử lý nƣớc thải. Theo thông báo của GRSA (Generally Recognized as Safe), loài B. amyloliquefaciens thuộc loài vi khuẩn an toàn cấp độ 1. Ngoài ra, các loài vi khuẩn P. plecoglossicida và P. putida cũng đƣợc sử dụng trong xử lý nƣớc thải, làm phân bón hữu cơ do có khả năng kích thích phát triển cây trồng và sinh enzyme thủy phân, ức chế các vi khuẩn gây bệnh thực vật…[9]. Do vậy, ba chủng vi khuẩn đƣợc định danh P. plecoglossicida PK 1.19, B.
amyloliquefaciens ND1.15, và P. putida ND1.9 đƣợc đánh giá là an toàn và thích
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
A B
C
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
PK1.19 (A), ND1.15 (B) và ND1.9 (C) với các trình tự tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn khác trên GenBank (NCBI).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/