2.5.4.1. Tách DNA tổng số của vi khuẩn
Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn đƣợc tiến hành theo các bƣớc cơ bản sau [2], [10]:
Lấy 5 ml môi trƣờng đã nuôi vi khuẩn ở pha cân bằng (20 - 24 giờ). Thu tế bào từ 1,5 - 3 ml, ly tâm 5000 rpm trong 10 phút thu cặn.
Hòa tan lại tế bào trong 510 µl TE buffer (pH 8.0) (50 mM Tris; 10 mM EDTA, pH 8.0).
Bổ sung 60 µl EDTA 0,5M; pH 8,0.
Thêm 5 µl protease K (stock: 20 mg/ml TE buffer).
Bổ sung 60 µl lyzozyme (stock: 50 mg Lyzozyme / 1 ml TE pH 8,0); Ủ ở 65o
C trong 1 - 2 giờ;
Bổ sung 5 µl proteinase K, 30 µl Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)10%; Thêm 110 µl NaCl 5,0M;
Bổ sung 90 µl Chất hoạt động bề mặt Cetyl Trimetyl Ammonium Bromua (CTAB) trong dung dịch BaCl 0,9M (CTAB 10%, NaCl 0,7mM (hòa tan 4,1 g NaCl trong 80 ml H2O, mix chậm và thêm 10g CTAB, gia nhiệt ở 65oC thêm đến 100 ml).
Chiết ngay lập tức với 0,7 ml chloroform:iso amyl alcohol (24 : 1).
Ly tâm 10.000 rpm trong 10 phút, hút lấy pha trên chuyển vào ống eppendorf.
Chiết 3 lần với 0,7 ml phenol : chloroform : iso amyl alcohol (25 : 24 : 1), đảo trộn nhẹ nhàng 20 phút/1 lần chiết.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút và hút pha trên sang ống eppendorf. Kết tủa với 500 µl iso propyl alcohol (-20o C) qua đêm.
Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút loại dịch.
Rửa tủa 2 lần với 0,5 ml/ethanol 100% ở đảo trộn nhẹ nhàng, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, loại dịch.
Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 1 - 2 giờ. Thêm 1,0 µl TE/Rnase.
Hòa tan tủa nhanh trong 40 µl TE buffer, pH 8,0, mix gently. Bảo quản 4oC. Điện di kiểm tra trên agarose 1%.
2.5.4.2. Khuếch đại gen 16S rDNA của vi khuẩn
Gen 16S rDNA của vi khuẩn đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 14R có trình tự nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự mồi 27F và 14R
Tên đoạn mồi Trình tự mồi
27F 5’- TAACACATGCAAGTCGAACG – 3’ 14R 5’- GGTGTGACGGGCGGTGTGTA - 3’ - Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong hỗn hợp gồm: DNA 1,0µl Taq polymerase 0,2 µl Mồi 27F (10 pmol/µl ) 1,0 µl Mồi 14R (10 pmol/µl ) 1,0 µl Dung dịch đệm (10 X ) 2,0 µl Dung dịch MgCl2 (50 nM ) 0,6 µl Hỗn hợp các deoxyribonucleotide triphosphate (10 nM) 0,4 µl
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Nƣớc đề ion 13,8 µl
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ - Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo chu trình nhiệt
Nhiệt độ Thời gian
94oC 5 phút 30 chu trình 94oC 90 giây 51oC 60 giây 72oC 90 giây 72oC 10 phút
4oC Bảo quản mẫu
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kích thƣớc của các đoạn DNA thu đƣợc sau phản ứng PCR đƣợc so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 - Avant Genetic Analyzer (USA) tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.5.4.3. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn
Trình tự gen 16S rDNA đƣợc so sánh với các trình tự gen tƣơng ứng bằng công cụ BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). Cây phân loại vi khuẩn đƣợc vẽ bằng phần mềm TreeView (ver. 1.6.6).
2.5.5. Lựa chọn môi trƣờng và điều kiện lên men thích hợp cho 03 chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn
- Lựa chọn môi trường lên men:
Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong các môi trƣờng AM1, AM2, MT3, MT4, MT5 trên máy lắc 220 vòng/phút ở 30oC trong 24 giờ và xác định sinh khối đạt đƣợc (qua giá trị OD 600nm). Môi trƣờng tạo mật độ sinh khối vi khuẩn lớn nhất đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp ở các giá trị pH ban đầu từ 6,0 - 10,0 trên máy lắc 220 vòng/phút ở 30o
C trong 24 giờ và xác định sinh khối đạt đƣợc (qua giá trị OD 600nm). pH ban đầu trong môi trƣờng tạo mật độ sinh khối vi khuẩn lớn nhất đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu xác định nhiệt độ đƣợc thực hiện tƣơng tự (trong dải nhiệt độ 25, 30, 37, 40, 45oC) trên môi trƣờng thích hợp, pH thích hợp. Nhiệt độ thích hợp cho lên men là nhiệt độ tạo sinh khối lớn nhất sau 24 giờ nuôi cấy.
Xác định tỷ lệ thông khí (dựa trên tỷ lệ thể tích môi trƣờng/thể tích bình lên men đạt 25, 50, 75% (v/v)) đƣợc thực hiện tƣơng tự trên môi trƣờng thích hợp, pH và nhiệt độ đƣợc lựa chọn sau 24 giờ nuôi cấy.